[发明专利]一种提纯植物多糖的方法

说明书

本发明公开了一种提纯植物多糖的方法，属于食品分离纯化领域。该方法是将样品进行蛋白酶酶解，干燥后，利用三氟甲磺酸切割结合多糖的多肽，采用芴甲氧羰酰氯法或氯甲酸叔丁酯法将游离多肽的氨基端衍生化，用乙酸乙酯萃取去除多酚及衍生化的多肽物质，制备得到纯化过的多糖。此方法的优点在于：1、此方法提纯后，蛋白和多酚的含量大幅度降低。2、本发明分离出的高纯度的多糖。

技术领域

本发明涉及食品分离纯化领域，特别是指一种提纯植物多糖的方法。

背景技术

多糖是由糖苷键结合的糖链，至少要超过10个的单糖组成的聚合糖高分子碳水化合物，可用通式(C₆H₁₀O₅)_n表示。由相同的单糖组成的多糖称为同多糖，如淀粉、纤维素和糖原，以不同的单糖组成的多糖称为杂多糖，如阿拉伯胶是由戊糖和半乳糖等组成。它是生物体内一种重要的组成成分，常规的农副产品植物资源，例如大米、马铃薯等，一般均含有较多的多糖（分为游离型多糖和结合型多糖），同时也含有较多的蛋白或多酚，许多多糖能与蛋白之间共价结合形成糖蛋白。有些糖蛋白的比例非常高，大部分分布在细胞膜上，具有识别功能。多酚类成分的化学结构中含有较多的羟基，在植物体内能与蛋白质、多糖或其他物质以氢键和疏水键形式形成较为稳定的复合物。研究发现，植物多糖具有多方面的生物活性，如抗肿瘤、免疫促进、抗炎、抗病毒、抗凝血、降血糖等。然而，要分析多糖的功能首先要获得较纯多糖样品，去除样品原料中的蛋白和多酚，防止其对结果进行干扰。

常用的多糖的分离方法为水溶醇沉法，利用乙醇可以将溶液中的多糖沉淀下来，从而提纯多糖。其缺点在于一方面非结合蛋白、多酚能与多糖形成共沉淀，另一方面沉淀的多糖含有部分结合蛋白，导致提取的多糖纯度低。结合型多糖的蛋白与多糖之间的共价键可以采用化学裂解法切割，常用的试剂为三氟甲磺酸。

由于多酚物质在分子结构中具有酚羟基、羟基、羧基等，具有一定的极性，在植物体内通常与蛋白质、多糖以氢键和疏水键形式形成稳定的化合物，而有机溶剂具有断裂氢键的作用，因此可以用乙酸乙酯、丙酮、乙醇等有机溶剂萃取，除去多酚。

为了尽可能多的除去蛋白和多酚，同时提高多糖的纯度，需要一种有效的分离多糖的纯化方法。在提纯多糖之前先将糖蛋白中的蛋白与糖链分开，并对多酚进行萃取，从而提高多糖纯度的文献还未见报道。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种工艺简单，能够制备高纯度多糖的分离方法。具体为将样品进行蛋白酶酶解，干燥后，利用三氟甲磺酸切割结合多糖的多肽，采用9-芴甲氧羰基法（Fmoc）或叔丁氧羰基（Boc）法将游离多肽的氨基端衍生化，用乙酸乙酯萃取去除多酚及衍生化的多肽物质，达到分离提纯多糖的目的。

为了实现上述发明目的，其具体的技术方案如下：

一种提纯植物多糖的方法，按照下述步骤进行：

（1）蛋白酶解

将蛋白样品加入蒸馏水混匀（底物浓度30~70 g/L），调节pH至8~9，温度45~55℃，加入蛋白酶底与底物比为0.5~2.5%的碱性蛋白酶，酶解时间5~12 h，沸水浴灭酶10~20min，离心取上清液，冻干。

（2）糖蛋白链断裂

准确称取上述绝干样品加入到预冷的样品管中，按0.3 mL/mg（蛋白酶酶解物样品）加入三氟甲磺酸，快速封口，轻摇2~5 min使样品溶解，于4℃下保温30~60 min，偶尔摇动，样品管中加入少量2%溴酚蓝指示剂，于-20℃下预冷，在干冰甲醇浴的环境下，用预冷的60%吡啶滴定，直至溴酚蓝变成浅紫色或蓝色，此时溶液pH约为6.0，最后对去离子水透析并冷冻干燥。

（3）分离多糖

将多肽进行氨基端疏水性衍生化，增加与多糖的极性差异，可采用Fmoc或Boc法。