[发明专利]对枯草芽孢杆菌T-500高产脂肽抗生素的摇瓶发酵工艺优化的方法

说明书

本发明具体涉及一种对枯草芽孢杆菌T‑500高产脂肽抗生素的摇瓶发酵工艺优化的方法，属于枯草芽孢杆菌T‑500脂肽类抗生素的发酵工艺技术领域。本发明以水稻纹枯病菌为指示菌，基于10种常用的发酵培养基，利用酸沉淀法提取脂肽类抗生素，并进行T‑500粗提液抑菌效果分析，筛选影响抑菌效果的发酵培养基成分；通过Plackett‑Burman实验设计、中心组合实验设计(CCD)和响应曲面法，优化了T‑500高产脂肽类抗生素的发酵培养基成分及发酵条件。本发明为枯草芽孢杆菌T‑500菌株工业化生产和获得高产脂肽类抗菌物质提供了技术支撑和理论指导。

技术领域

本发明属于枯草芽孢杆菌T-500脂肽类抗生素的发酵工艺技术领域，具体涉及一种对枯草芽孢杆菌T-500高产脂肽抗生素的摇瓶发酵工艺优化的方法。

背景技术

芽孢杆菌是一种目前研究较为深入的生防菌资源，它具有发达的分泌系统和较强的环境适应性，对多种植物病原菌具有拮抗性，且无毒、无污染、无残留，不易使病原菌产生抗药性，目前已被广泛应用于生物农药的创制和开发。国内外已推广应用的活性菌株有Bacillus amyloliquefaciens FZB42，Bacillus subtilis GB03和Bacillus pumilusGB34等；陈志谊等开发的微生物杀菌剂“纹曲宁”，其活性成分为枯草芽孢杆菌Bs916，该制剂对水稻纹枯病、稻曲病具有良好防效。

已有生防机理研究表明，芽孢杆菌非核糖体合成途径产生的脂肽类抗生素，如Surfactin(表面活性素)，Iturin(伊枯草菌素)和Fengycin(泛革素)等，具有直接杀死或抑制病原物生长、与病原菌进行营养和空间的竞争及诱导植物产生抗病性的作用。目前，芽孢杆菌发酵的常用培养基主要成分有小麦粉、玉米糊、黄豆饼粉、鱼粉和酵母膏(粉)以及一些微量元素(阳离子)，然而，针对不同的菌株，培养基组分的不同对发酵液菌含量和抗菌物质合成影响较大。张荣胜等对解淀粉芽孢杆菌Lx-11进行了发酵培养基的优化，使得发酵菌含量和抑菌效果分别提高了180％和30％。章四平等通过对B.subtilis NJ-18发酵优化研究，发现豆粕对菌含量和抑菌活性影响最大。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)T-500是本研究室前期分离获得的一株对水稻纹枯病和稻瘟病均有良好防治效果的生防菌。该菌株已经在中国普通微生物保藏中心进行保藏，并申请了名称为“一株枯草芽孢杆菌及其应用”、申请号为201210328716.5的发明专利，且已经获得授权。此外，本研究室基于T-500为活性成分进行了枯草芽孢杆菌干悬浮粉剂的研制，申请了名称为“一种枯草芽孢杆菌的干悬浮剂及其制备方法”、申请号为201310301606.4的发明专利，并获得授权。为了进一步提高枯草芽孢杆菌T-500干悬浮粉剂中脂肽类抗生素的含量，本研究通过比较已报道的10种常用于芽孢杆菌发酵的培养基和发酵条件对T-500菌株产脂肽类抗生素的影响，筛选影响T-500的脂肽类抗生素的关键培养基成分和培养条件因子；并通过响应面法对发酵工艺进行优化，以期为该菌株工业化生产和获得高产脂肽类抗菌物质提供技术支撑和理论指导。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有枯草芽孢杆菌T-500干悬浮粉剂中脂肽类抗生素的含量较低的不足，而提供一种对枯草芽孢杆菌T-500高产脂肽抗生素的摇瓶发酵工艺优化的方法，本发明为枯草芽孢杆菌T-500菌株工业化生产和获得高产脂肽类抗菌物质提供技术支撑和理论指导。

本发明采用如下技术方案：

对枯草芽孢杆菌T-500高产脂肽抗生素的摇瓶发酵工艺优化的方法，包含如下步骤：

步骤一：制备枯草芽孢杆菌T-500的发酵种子液，并从发酵过程中得到的发酵液中提取脂肽类抗生素，脂肽类抗生素的提取具体为：将枯草芽孢杆菌T-500发酵过程中得到的发酵液进行离心，上清液进行酸沉淀，调节pH，过夜，离心收集沉淀，晾干后，加入色谱级甲醇溶解沉淀，并调节pH，溶解后离心获得甲醇溶液，后用细菌滤器过滤，得到无菌甲醇滤液；