[发明专利]一种α‑半乳糖苷酶基因及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种α-半乳糖苷酶基因及其应用。

背景技术

α-半乳糖苷酶(α-Galactosidase)，也称蜜二糖酶，是一种外切糖苷水解酶，能够催化水解各类以α键结合的非还原性末端α-半乳糖苷化合物，如蜜二糖、棉子糖家族寡糖(棉子糖、水苏糖等)、乳糖(半乳糖)-甘露聚糖、半乳糖。

在饲料工业中，豆粕是应用最广泛的植物性蛋白质原料，但是豆粕中的α-半乳糖苷糖类含量比较高，如棉子糖、水苏糖和毛蕊花糖等，是饲料中的抗营养因子之一。在饲料中添加α-半乳糖苷酶可有效的降解饲料中的抗营养因子，减少胀气、消化不良等症状，同时提高饲料的营养利用率。

但是在工业生产加工中常常伴随着高温出现，如酶液的喷雾干燥，饲料的制粒、膨化，从而影响α-半乳糖苷酶的应用效果，因此在工业应用中就需要耐高温、高酶活的α-半乳糖苷酶

现在一般通过PCR技术从相关产α-半乳糖苷酶的微生物中扩增出α-半乳糖苷酶的基因，连接到表达载体中，再导入相关表达宿主，表达α-半乳糖苷酶。但是这样获得的α-半乳糖苷酶一般最适温度比较低，最适pH偏中性，蛋白的表达量较小，工业应用限制较大。还有研究人员通过各种手段构建外源基因(一般是小片段基因)的多拷贝表达载体来提高外源基因在宿主中的表达量；还有的将HAC1、PDI等基因和外源基因分别导入宿主细胞内来提高外源基因的表达量。

传统上一般是从自然界产α-半乳糖苷酶的微生物中筛选菌株，然后对菌株进行改良，或者对发酵工艺进行优化。这样筛选的α-半乳糖苷酶的酶活和蛋白表达量一般不高，最适温度较低，在工业生产中易失活。

密士军克隆了来源于青霉的α-半乳糖苷酶基因，并在毕赤酵母GS115中表达，表达量最高的一株转化子在3L发酵罐水平α-半乳糖苷酶的酶活力达111U/mL，约为国外最高酶活力的2倍，是国内构建的α-半乳糖苷酶基因工程菌株的3倍。重组酶的最适pH5.0，最适温度为40℃。李荷等克隆了分枝犁头霉Absidia ramosa WL511的热稳定α-半乳糖苷酶cDNA基因aga(GenBank No.DQ234280)，将aga基因插入表达载体pPICZαA并电转化整合到毕赤酵母P.pastoris GS115上表达，酵母发酵上清的酶活达到32U/mL，最适pH为6.8，最适温度73℃。

毕赤酵母表达系统是目前广泛使用的真核生物表达体系。它具有生物安全性好、遗传元件稳定、高密度发酵工艺成熟以及目的蛋白分离纯化简便等优点，是异源蛋白质工业化生产的理想宿主。

然而，由于受到毕赤酵母对异源基因密码子使用偏好性、mRNA二级结构的复杂性、基因中富含A/T或G/C区段、蛋白酶切割位点以及基因在宿主中的丰度等因素影响，异源基因在毕赤酵母中难以获得高效表达。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种α-半乳糖苷酶基因，其适于编码α-半乳糖苷酶，该α-半乳糖苷酶基因的碱基序列经过密码子优化，采用了适用于毕赤酵母进行转录翻译表达出α-半乳糖苷酶的高频密码子，有利于提高该α-半乳糖苷酶基因在毕赤酵母细胞中α-半乳糖苷酶的表达量。

本发明的另一目的在于提供一种表达盒，该表达盒含有上述的α-半乳糖苷酶基因。

本发明的另一目的在于提供一种载体，其含有上述的α-半乳糖苷酶基因。

本发明的另一目的在于提供一种重组细胞，其含有上述的载体。

本发明的另一目的在于提供上述α-半乳糖苷酶基因在生产α-半乳糖苷酶中的应用。

本发明的另一目的在于提供上述α-半乳糖苷酶基因在水解棉籽糖或水苏糖中的应用。

本发明是这样实现的：

一种α-半乳糖苷酶基因，其适于编码α-半乳糖苷酶，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

一种表达盒，其含有上述的α-半乳糖苷酶基因。

一种载体，其含有上述的α-半乳糖苷酶基因。

一种重组细胞，含有上述的载体。

上述α-半乳糖苷酶基因在生产α-半乳糖苷酶中的应用。

上述α-半乳糖苷酶基因在水解棉籽糖或水苏糖中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：