[发明专利]基因工程化类球红细菌及其制备方法和法尼醇的生产方法

说明书

本发明公开了基因工程化类球红细菌及其制备方法和法尼醇的生产方法。本发明通过将来自于鼠疫耶尔辛杆菌Yersinia pestis CO92的磷酸酶PgpB基因转化到类球红细菌能够在胞内表达，并产生具有活性的磷酸酶PgpB，从而可以直接催化类球红细菌MEP途径积累的焦磷酸法尼酯生成法尼醇。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地涉及一种类球红细菌以及利用类球红细菌生产法尼醇的方法。

背景技术

法尼醇(Farnesol)是一种无环倍半萜醇，化学式C₁₅H₂₆O，痕量存在于巴西檀木、黄葵子、金合欢、香茅、柠檬草、麝香、茉莉及橙花的香精油中。长期以来法尼醇作为一种香精成分广泛应用于化妆品行业，近年来的研究发现法尼醇还具有抑菌、抗炎和抗肿瘤等多种生物活性。除此之外法尼醇作为药物成分可以显著增加多种病原微生物(如金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、变形链球菌、禾谷镰刀菌等)对药物的易感性。

目前在国内外法尼醇的生产和提取方法还是从植物中提取为主。例如，中国专利申请CN102675398A公开了一种从罗汉果中提取罗汉果昔V和法尼醇的方法。干罗汉果经破壳、减压浓缩、陶瓷膜过滤、大孔树脂吸附、梯度乙醇洗脱等步骤，将不同洗脱液进行脱色，采用结晶重结晶的方法分别得到罗汉果昔V和法尼醇纯品。由于在植物中的含量极少，导致法尼醇的提取和纯化都非常困难，因此此类方法的生产成本居高不下。

利用微生物合成并生产法尼醇是近几年发展起来的技术，微生物生产方法具有培养过程简单、生产周期短、提取和纯化步骤少等优势，是目前工业化大规模生产法尼醇等萜烯类化合物的理想途径。

中国专利申请CN103571763A公开了一株从白酒酒醅中筛到的酿酒酵母，这种酿酒酵母能够自身从头合成多种萜烯醇，该酵母除了能够生产法尼醇之外还可以合成里哪醇、α-萜品醇、香茅醇、月桂烯醇、橙花叔醇、α-没红药醇等萜烯类化合物，但是包括法尼醇在内的多种萜烯类化合物的产量均较低。

美国专利US 6689593公开了一种利用酵母或者大肠杆菌生产法尼醇的方法。该方法利用基因工程手段对酵母或大肠杆菌进行改造，降低了微生物胞内鲨烯合成酶的活性，同时过表达HMG-CoA还原酶基因和焦磷酸法尼脂合成酶基因，从而强化了HMG-CoA还原酶和焦磷酸法尼脂合成酶的活性。利用这种改造方法可以积累足够多的焦磷酸法尼脂，能够实现法尼醇和香叶醇在微生物胞内的合成。

综上所述，目前国内外利用微生物生产法尼醇的报道很少。本领域内仍然需要微生物合成法尼醇的新方法。

发明内容

本发明发现将来自于鼠疫耶尔辛杆菌Yersinia pestis CO92的磷酸酶PgpB基因转化到类球红细菌能够在胞内表达，并产生具有活性的磷酸酶PgpB，从而可以直接催化类球红细菌MEP途径积累的焦磷酸法尼酯生成法尼醇。至少基于上述部分发现完成了本发明。具体地，本发明包括以下内容。

本发明的一方面，提供基因工程化类球红细菌，其包含来自鼠疫耶尔辛杆菌Yersinia pestis CO92的磷酸酶PgpB基因，且所述磷酸酶PgpB基因能够在所述类球红细菌的胞内表达，形成具有活性的磷酸酶PgpB。

在示例性实施方案中，所述类球红细菌的胞内包含焦磷酸法尼酯。优选地，所述焦磷酸法尼酯通过在胞内利用丙酮酸和3-磷酸甘油醛为起始物质合成二甲基丙烯焦磷酸酯(DMAPP，异戊二烯焦磷酸异构体)，进而在法尼基焦磷酸合成酶的作用下生成。

在示例性实施方案中，所述类球红细菌为Rhodobacter sphaeroides 2.4.1，其菌种编号ATCC17023。

在示例性实施方案中，所述磷酸酶PgpB基因的碱基序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明的另一方面，提供基因工程化类球红细菌的制备方法，其包括：