[发明专利]基因工程化类球红细菌及其制备方法和法尼醇的生产方法

权利要求书

1.一种基因工程化类球红细菌，其包含来自鼠疫耶尔辛杆菌CO92的磷酸酶PgpB基因，且所述磷酸酶PgpB基因能够在所述类球红细菌的胞内表达，形成具有活性的磷酸酶PgpB；

其中，在所述类球红细菌的胞内包含焦磷酸法尼酯或可转化为所述焦磷酸法尼酯的物质；

其中，所述焦磷酸法尼酯通过在胞内利用丙酮酸和3-磷酸甘油醛为起始物质合成二甲基丙烯焦磷酸酯，进而在法尼基焦磷酸合成酶的作用下生成。

2.根据权利要求1所述的基因工程化类球红细菌，其中，所述类球红细菌的菌种编号为ATCC17023。

3.根据权利要求1所述的基因工程化类球红细菌，其中，所述磷酸酶PgpB基因的碱基序列如SEQ ID NO:1所示。

4.一种基因工程化类球红细菌的制备方法，其包括：

构建重组质粒并转化的步骤；和

通过细菌接合转化所述重组质粒至类球红细菌的步骤；

其中，所述构建重组质粒并转化的步骤包括：

使用SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的引物从鼠疫耶尔辛杆菌CO92的基因组中克隆磷酸酶PgpB1基因；

以pBBR1MCS2载体为模板，使用SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的引物克隆得到所述pBBR1MCS2载体的拼接片段，回收所述拼接片段；

将所述PgpB基因和所述拼接片段混合，40-60℃反应10-60分钟，反应完毕之后转化大肠杆菌T1细胞，挑取阳性克隆，提取质粒pBBR1MCS2-PgpB，将提取的质粒pBBR1MCS2-PgpB转化大肠杆菌S17-1，挑取能够在含Kan抗性的培养基上生长的阳性菌株，提取质粒验证，获得含有pBBR1MCS2-PgpB正确序列的大肠杆菌S17-1克隆作为供体菌。

5.根据权利要求4所述的基因工程化类球红细菌的制备方法，其中，所述通过细菌接合转化所述重组质粒至类球红细菌的步骤包括：

在含有Kan抗生素的液体培养基中培养所述供体菌，在所述供体菌的OD₆₀₀达到0.4-0.6之间时停止培养并收集菌体；

在液体培养基中培养所述类球红细菌，在其OD₆₀₀达到0.3-0.6之间时停止培养并收集菌体作为受体菌；

将收集的所述供体菌和所述受体菌分别稀释重悬，并将所述供体菌和所述受体菌混合后涂布到固体无抗性平板培养基上培养，取平板上生长的菌落洗涤、重悬；

将重悬后的菌落涂布在含亚碲酸钾和Kan的平板上培养后，挑取黑色接合子，即为所述基因工程化的类球红细菌。

6.一种法尼醇的生产方法，其包括使用根据权利要求1-3任一项所述的基因工程化类球红细菌的步骤。

7.根据权利要求6所述的法尼醇的生产方法，其进一步包括所述基因工程化类球红细菌的发酵培养步骤，和/或法尼醇的检测步骤。