[发明专利]制备甘露糖偶联近红外量子点的方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞示踪技术领域，尤其涉及一种制备甘露糖偶联近红外量子点的方法。

背景技术

免疫细胞示踪标记在生物医学研究中非常有意义，甘露糖受体蛋白广泛表达于多种免疫细胞，甘露糖偶联的量子点是一种非常好的免疫细胞荧光标记材料。

作为一种用于生物荧光标记的纳米粒子，量子点的光学稳定性大大优于有机荧光染料或荧光蛋白，在连续光激发下可以保持稳定的发光亮度和高量子效率。量子点具有宽的吸收光谱及窄的荧光发射光谱，可以通过改变其尺寸或组成调节其发光光谱。单波长可以同时激发具有不同发光谱带的量子点，使得多路复用技术(multiplexing)成为可能。其生物稳定性、生物相容性及其与生物体系的相互作用可以通过改变表面性质来调节。这些特点使得量子点纳米粒子在生物荧光标记的应用上具有有机荧光分子或荧光蛋白无法实现的优点。有望在将来成为新一代的生物荧光标记材料并用于包括细胞标记及示踪、蛋白质印迹(western blot)、流式细胞计、酶联免疫吸附、基因芯片、分子成像等生物应用。

目前全世界在制备量子点的方式上常见的有：

1.通过有机金属合成。但含镉的量子点具有较大的毒性，且使用该种方式合成得到的量子点具有疏水性，需要与水溶性分子的相互作用转化为亲水的纳米粒子才能用于生物应用。

2.糖修饰的量子点。其通常采用的方法是，功能化的糖分子通过螯合作用包覆于量子点表面，或生物素(biotin)偶联的糖分子与链霉亲和素(streptavdin)偶联的量子点结合，或通过疏水相互作用的功能化。但这些方法得到的产物或者稳定性差，或者步骤复杂，重复性差，不宜工业化。

因此，针对以上缺陷，需要对现有技术进行改进。

发明内容

针对以上缺陷，本发明提供一种制备甘露糖偶联近红外量子点的方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

第一步，制备酰亚胺功能化甘露糖。

首先，将2-溴代甘露糖乙酯及硫脲溶于无水丙酮，氩气保护下加热至丙酮回流，反应20分钟；冷却反应物至室温得到白色结晶；过滤反应液收集晶体，得到产物2-硫代异脲基甘露糖乙酯溴化氢。

其次，将2-硫代异脲基甘露糖乙酯溴化氢，氯乙氰溶于丙酮和水的混合溶液；在反应液中加入碳酸钾及亚硫酸钠，室温下反应30分钟后加入冰水，搅拌2小时；收集沉淀水洗；粗产物硅胶柱层析分离提纯，得到产物2-硫代乙氰基甘露糖乙酯。

最后，将 2-硫代乙氰基甘露糖乙酯溶于无水甲醇，向反应液中加入甲醇钠溶液，氩气保护下室温反应20小时，得到酰亚胺功能化甘露糖。

第二步，制备胺基功能化近红外量子点。

首先，制备疏水的氨基近红外铜铟硒/硫化锌量子点：

将氯化亚铜、氯化铟、硒脲、十八烯及三辛基膦的混合物超声30分钟，加入油胺及十二烷基硫醇，反应液经过无水无氧操作后加热至50-60摄氏度，搅拌10小时后得到无色透明的反应液；

将反应液冷却至室温后加热至200摄氏度，可见反应溶液的颜色从无色逐渐变为黄色，红色最终为黑褐色，反应温度至200度后立即终止反应并降温；

向反应混合物中加入甲醇/丙酮混合溶剂，沉降的纳米粒子经过高速离心分离后溶于无水氯仿中，用0.22微米的尼龙滤头过滤；

铜铟硒量子点的氯仿溶液与十八烯、油胺置于反应瓶中，真空条件下除去氯仿，得到疏水的氨基近红外铜铟硒/硫化锌量子点。

其次，制备二乙基黄原酸锌反应液：

将二乙基黄原酸锌与油酸锌溶于十八烯、三辛基膦及二辛基胺的混合溶液得到锌溶液并分成两部分，先将一部分的锌溶液加入铜铟硒量子点溶液中加热至190度，反应后再将另一部分剩余的锌溶液加入反应溶液中继续反应；

将反应混合物冷却至室温，加入丙酮/甲醇（1/3体积比）沉降纳米粒子。离心分离后的纳米粒子溶于氯仿中并过滤，得到的溶液用于配体交换。

再次，合成多齿胺基聚合物配体：

使聚丙烯酸与CDI在有机溶剂存在下反应，加入BOC保护的氨基PEG，再加入N,N-二甲基乙二胺和硫辛胺的氯仿溶液进一步反应，得到的产物用饱和氯化钠水溶液洗三次后收集有机相，分离提纯得到聚合物配体前体物，使所得聚合物配体前体物与1，3-丙环酰内酯反应，和分离提纯得到多齿胺基聚合物配体。