[发明专利]一种高效的转座突变系统及构建方法

说明书

本发明涉及一种高效的转座突变系统及构建方法。本发明构建了一种可高效富集转座突变株，且突变株之间重复性低的双质粒转座突变系统，以及一种可去除转座酶编码基因的单质粒转座突变系统。本发明得到的转座子突变系统可以筛选获得表型突变株，之后，可通过染色体步移技术快速的确定突变株的基因型。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，更具体地，本发明涉及一种高效的转座突变系统及构建方法。

背景技术

应用于酵母随机突变的技术主要有化学诱变和紫外诱变，这些传统的诱变方法筛选得到的突变株基因型难以得到鉴定。而转座子突变标签技术是一种根据转座子随机插入引起突变的特性而发展起来的可分离未知基因的诱变方法。然而现有的用于酵母中的转座子系统普遍存在转座效率低下、插入突变的随机性不强、操作较为繁琐等问题，使得酵母中的转座子突变系统得不到普遍的应用，筛选突变株和研究对应的基因功能的工作进展缓慢。

转座子是一段可移动的DNA片段，它可从染色体或质粒的一个位置跳到另一个位置。当外源转座子整合进入某未知基因的启动子区域或编码区域，使基因突变失活并产生一种新的突变表型，此时再根据转座子上设计的已知序列来克隆失活的基因，并以此作为探针，在野生型中克隆获得原本未失活的基因，从而达到鉴定该未知基因的目的。转座子突变标签技术是定向研究基因的有效方法，也是目前开展基因定位及其功能研究，特别是一系列调控基因研究的首选方法。转座子标签的设计基本原理是：只保留转座子上完成转座过程的特定片段，同时加入筛选标记(如抗性基因)和报道基因。该技术具有快速、准确以及规模化寻找与某一表型相关基因的特点。

毕赤酵母的基因组序列已经被公开，并且被预测出5000多个基因。其中绝大部分基因并没有得到实验验证，且被注释为假定蛋白的基因就有1600多个。为便于快速，大面积地研究未知功能基因，在毕赤酵母中建立高效的转座插入突变系统将具有很高的实用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效的转座突变系统及构建方法。

在本发明的第一方面，提供一种双质粒转座突变系统，以酵母细胞为宿主细胞，包括：

(1)转座酶表达盒，其整合于酵母细胞的基因组上；和

(2)游离在酵母细胞中的质粒，该质粒包含：转座元件；且，该质粒不包含酵母可识别的复制位点序列。

在一个优选例中，所述的转座酶表达盒包括(5’→3’)：启动子，转座酶编码基因和终止子；较佳地，所述的启动子选自：诱导型或阻遏型启动子。

在另一优选例中，所述的启动子是阻遏型启动子，包括(但不限于)选自下组的启动子：硫胺素阻遏型启动子PpTHI11p或甲硫氨酸阻遏型启动子PpMET3p；或所述的启动子是诱导型启动子，包括(但不限于)启动子：甲醇诱导型启动子PpAOX1p。

在另一优选例中，所述的硫胺素阻遏型启动子PpTHI11p的核苷酸序列如SEQ IDNO:5所示。

在另一优选例中，所述的甲硫氨酸阻遏型启动子PpMET3p的核苷酸序列如SEQ IDNO:6所示。

在另一优选例中，所述的甲醇诱导型启动子PpAOX1p的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示。

在另一优选例中，所述的转座酶包括(但不限于)选自下组的转座酶：TcBase_COV596A转座酶，SBase100X转座酶，piggyBac转座酶。

在另一优选例中，所述的转座酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示；或所述的转座酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示。

在另一优选例中，所述的转座元件包括操作性连接的转座子末端重复区域和筛选标记基因序列。