[发明专利]一种日本血吸虫和破伤风双价口服或滴鼻疫苗

说明书

技术领域

本发明涉及一种疫苗，具体涉及一种以IL-2为佐剂，芽孢型益生菌为粘膜递送载体的双价疫苗。

背景技术

使用新一代纳米级生物载体，即枯草杆菌的纳米级芽孢作为粘膜递送载体研发口服或滴鼻疫苗，预计1个月时间的工业生产即可满足高危人群免疫的需求。通过发酵技术生产的芽孢疫苗，比传统鸡胚疫苗培养时间大大缩短，预计每剂量单位成本仅为传统方法生产成本的1/10。因此，研发周期短、生产快、成本低、对外界环境抗干扰能力强、易于储存运输、能产生持久的交叉保护效果、具有佐剂效应的新型疫苗，已成为全世界传染病预防控制的迫切需求。以枯草芽孢杆菌为粘膜疫苗递送载体所构建的疫苗可以满足这些需求。

本发明利用枯草芽孢杆菌内生芽孢构建了多价抗原融合表达体系，选用日本血吸虫26kDa GST(Sj26GST)蛋白为模式抗原和破伤风毒素C片段(TTFC)作为免疫佐剂分子，在芽孢外表面展示(与芽孢CotC外壳蛋白融合表达CotC-Sj26GST-TTFC)；并构建与芽孢外表面展示IL-2(与芽孢CotB-IL-2外壳蛋白融合表达)双转构建相结合的方式表达。荧光免疫学实验、激光共聚焦显微镜检测到外源蛋白在芽孢外表面成功地表达，也证明了多价重组抗原的大分子结构不影响芽孢外层蛋白的组装和芽孢形成，同时证明了IL-2能提高疫苗的细胞免疫水平。

合成或重组表达的口服或滴鼻免疫芽孢能引起广效的免疫反应，但诱导的CD8+T细胞免疫水平相对较低。因此本发明利用白细胞介素-2(IL-2)调节免疫类型并增强细胞免疫水平。

白细胞介素(interleukins，ILs)ILs是介导白细胞之间和其他细胞之间相互作用的细胞因子。由淋巴细胞、单核细胞或其它非单个核细胞产生的细胞因子，在细胞间相互作用、疫苗免疫调节、造血以及炎症过程中起重要调节作用。白细胞介素-2(IL-2)主要由CD4+T细胞或CD8+T细胞产生，以自分泌和旁分泌方式发挥效应。主要生物学功能包括：①活化CD4+和CD8+T细胞，促细胞因子产生；②刺激NK细胞增殖、活化，诱导LAK细胞产生；③促活化B细胞增殖及产生抗体；④可激活单核-巨噬细胞。IL-2为人体自身成分，可调节机体的生理过程和提高免疫功能，很低剂量即可发挥作用，疗效显著，副作用小，利用基因工程技术生产的重组细胞因子IL-2作为生物应答调节剂(biologicalresponse modifier，BRM)在治疗感染疾病亦取得了一定疗效，是一种全新的生物制剂，已成为新一代的药物被批准生产。

本发明引入生物应答调节剂IL-2，发挥其免疫调节的佐剂作用，调节免疫反应类型，增强细胞免疫水平，以提高外源重组抗原疫苗的免疫保护效果。

本发明采用的新型纳米级生物载体枯草芽孢杆菌，属革兰氏阳性菌，具有非致病性，分布广泛，通常存在于土壤中，美国食品和药物管理局FDA批准其为“常规安全级”(generally recognized as safe，GRAS)，常作为益生菌用于食品或药业。枯草芽孢杆菌在科研和工农业生产领域被广泛应用，具有良好的发酵基础和生产技术，其在相对简单的培养基中就能生长到很高的密度。很多商业用酶都是芽孢杆菌产生的胞外蛋白，例如α-淀粉酶、蛋白酶以及苏云金杆菌的杀虫晶体蛋白等。芽孢杆菌生长迅速、培养条件简单、遗传背景较清楚。芽孢杆菌的芽孢是一种休眠体(图1所示芽孢形成过程)，在外界抗性条件下能保持高度的稳定性，包括热稳定性，能抵御恶劣的环境条件。

芽孢这些特性归功于其独特的芽孢衣壳结构，芽孢的衣壳多层结构大约有70多种衣壳蛋白质(Cot proteins)构成(如图2)，组成芽孢的内壳、外壳和最外层的皮层crust衣壳层。其中位于最外层的三个衣壳蛋白CotB，CotC和CotG，常用于融合表达外源抗原蛋白或酶，展示于芽孢表面。