[发明专利]一种检测甲氨蝶呤的ELISA试剂盒及其应用

说明书

本发明的提供了一种检测甲氨蝶呤的ELISA试剂盒及其应用，所述试剂盒包括如下试剂：包被甲氨蝶呤的96孔微孔板，甲氨蝶呤单克隆抗体，抗体稀释液，HRP标记羊抗鼠二抗，甲氨蝶呤标准品，洗液浓缩液，样本稀释液，TMB显色液以及终止液。本发明通过各试剂的组合及对试剂参数的改进，得到一种稳定、快速、简便的甲氨蝶呤检测试剂盒，且应用时所述试剂盒标准偏差值较小。能同时用于大剂量甲氨蝶呤使用患者的血药浓度检测以及小剂量甲氨蝶呤治疗量患者血清中药物浓度检测。

技术领域

本发明属于免疫检测领域，具体涉及一种检测甲氨蝶呤的ELISA试剂盒及其应用。

背景技术

甲氨蝶呤(MTX)是用于治疗癌症和自身免疫疾病的药物。它被设计为抗叶酸盐以抑制叶酸的代谢。在癌症治疗中，甲氨蝶呤通过阻断叶酸结合竞争性抑制二氢叶酸还原酶(DHFR)，DHFR将二氢叶酸转化为活性四氢叶酸。DHFR的抑制导致抑制嘌呤和嘧啶碱基的合成，有效限制DNA和RNA合成和癌细胞生长。在自身免疫疾病中，特别是在类风湿性关节炎的治疗中，甲氨蝶呤似乎影响几种通路，导致T细胞活化的抑制。这些作用包括抑制细胞间粘附分子的T细胞表达，抑制甲基转移酶活性和增加CD95敏感性，导致活性T细胞凋亡。

监测甲氨蝶呤水平对于确保在治疗或治疗期间适当水平是重要的。高水平的甲氨蝶呤可以导致毒性和潜在的肾衰竭以及免疫抑制。此外，甲氨蝶呤已知与各种各样的药物相互作用，导致额外的并发症。确定来自受试者的样品中甲氨蝶呤的存在可以帮助解释研究结果。甲氨蝶呤被建立为类风湿关节炎的最有效和安全的治疗之一。安全性分析确保甲氨蝶呤将继续在新研究中与其他新药或既成药物联合使用。在其用作癌症治疗剂时也是如此。

大剂量的MTX常用于肿瘤、白血病的治疗，最新的儿童急性淋巴性白血病诊疗方案提出甲氨蝶呤使用剂量为2～5g/(m2.24h)，患者血清浓度可高达20μmol/L，常用检测方法主要有高效液相色谱法、荧光偏振免疫法、酶放大免疫法。近年来MTX用于类风湿关节炎、干燥综合征、银屑病关节炎等系统性自身免疫性疾病的治疗，常用剂量为5～20mg/周，患者服药后24h内血清MTX浓度最高为20nmol/L，两者浓度相差了近1000倍。传统的检测方法很难检出，现常用高效液相色谱质谱法检测。但色谱质谱法样本前处理较复杂，操作步骤也相对繁琐，且色谱质谱仪造价昂贵，检测成本高，不适合与大样本检测及基层开展。

发明内容

针对现有技术中的上述缺陷，本发明的主要目的在于提供一种检测甲氨蝶呤的ELISA试剂盒及其应用，所述试剂盒能快速、简便、稳定的检测样本中的甲氨蝶呤，且标准偏差值较小。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案:一种检测甲氨蝶呤的ELISA试剂盒，所述试剂盒包括如下试剂：包被甲氨蝶呤的96孔微孔板，甲氨蝶呤单克隆抗体，抗体稀释液，HRP标记羊抗鼠二抗，甲氨蝶呤标准品，洗液浓缩液，样本稀释液，TMB显色液以及终止液。

作为进一步的优选，所述包被甲氨蝶呤的96孔微孔板的制备方法包括如下步骤：

采用包被缓冲液将包被原稀释，将稀释后的所述包被原加入至微孔中，以封板膜贴封，包被过夜或恒温箱中包被温育2-4h；

所述包被过夜或温育后，甩掉板中液体后拍干，洗板，拍干，每孔加入封闭液，以封板膜贴封，于恒温箱中温育1-3h封闭；

所述封闭后，取板拍干，加入浸板液，于恒温箱中温育1-3h浸板；

所述浸板后，取板拍干，将板抽真空。

作为进一步的优选，所述包被原包括甲氨蝶呤-鸡蛋清白蛋白。

作为进一步的优选，所述包被缓冲液包括CB缓冲液；所述洗板的洗液包括1×TBST溶液，所述封闭液包括10×PBS溶液、牛血清以及牛血清白蛋白，所述浸板液包括10×PBS溶液、蔗糖及海藻糖。