[发明专利]一种分泌甲氨蝶呤单抗的杂交瘤细胞株及制备方法、应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种分泌甲氨蝶呤单抗的杂交瘤细胞株及制备方法、应用。

背景技术

甲氨蝶呤(MTX)是一种抗恶性肿瘤药、抗风湿药，属于叶酸代谢拮抗剂。作为抗癌剂，它用于治疗白血病和滋养细胞疾病。但是，它有抑制骨髓功能、导致肝肾功能障碍的严重副作用，必须在用药过程中进行多次临床检查，仔细观察患者的状态。通常，在使用MTX后应用四氢叶酸钙(CF)进行解救从而减轻MTX不良反应，但仍然有不同程度的毒性反应，甚至有致死的危险。如何保证临床上既要大剂量治疗肿瘤而又不致产生严重的毒副反应就是监测MTX血药浓度。

MTX测定的方法包括微生物学，荧光分光光度法和分光光度法酶抑制方法以及竞争性蛋白结合测定，放射性和酶免疫测定。在甲氨蝶呤的血药浓度测定方法中，59.09％采用高效液相色谱法，34.09％采用荧光偏振免疫分析法，其它方法仅占6.82％。由于这些方法对于MTX和结构相关分子存在缺乏选择性，目前已经开发了同时测量药物及其代谢物的高效液相色谱(HPLC)技术。尽管有这个优点，仍然需要可以在临床实验室中常规进行的MTX高灵敏的免疫测定方法。目前，只有MTX的血药浓度监测才能满足治疗的个体化，增加疗效，减少毒副作用，降低药动学差异，增加患者依从性。将近1/3的医院和研究机构必须寻找新的甲氨蝶呤血药浓度检测方法。而现有的抗体用于测定测试样品中甲氨蝶呤的存在或量的免疫测定时，由于特异性差而检测效果较差，常出现错误的测定结果。

发明内容

针对现有技术中的上述缺陷，本发明的主要目的在于提供一种分泌甲氨蝶呤单抗的杂交瘤细胞株及制备方法、应用，所述杂交瘤细胞株能产生抗甲氨蝶呤单克隆抗体，所述抗体具有高度特异性，用于特异性识别甲氨蝶呤。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：一种分泌甲氨蝶呤单抗的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株生物保藏编号为CCTCC NO:C201726。

一种分泌甲氨蝶呤单抗的杂交瘤细胞株的制备方法，所述方法包括如下步骤：

用抗原MTX-BSA(牛血清白蛋白)免疫Balb/c小鼠；

收集免疫小鼠的脾细胞，并与Sp2/0骨髓瘤细胞进行融合，融合的杂交瘤细胞用HAT培养基进行选择性培养；

采用间接竞争ELISA方法对杂交瘤细胞培养上清中的抗体含量进行检测，筛选获得稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

作为进一步的优选，所述免疫包括：所述小鼠为6-8周龄雌性Balb/c小鼠，将纯化的MTX-BSA蛋白与等体积的弗氏完全佐剂充分混合乳化，然后采用弗氏不完全佐剂乳化抗原，充分混合至油包水状态进行皮下多点免疫，2-3次加强免疫。

作为进一步的优选，所述融合包括：无菌条件下取小鼠脾脏制成细胞悬液，在PEG1450介导下，融合小鼠骨髓瘤SP2/0细胞与脾细胞，融合后加入DMEM培养基终止。

作为进一步的优选，所述小鼠骨髓瘤SP2/0细胞与脾细胞的个数比为1:5。

作为进一步的优选，所述检测包括：液体和半固体融合板检测。

作为进一步的优选，所述液体融合板检测包括：待融合板换液细胞长至中等大小约1万个细胞以上开始检测，在竞争法ELISA质控合格后挑选阳性孔作亚克隆。

作为进一步的优选，所述半固体融合板检测包括：常规细胞融合后，用甲基纤维素半固体培养基重悬细胞沉淀，重悬于20ml 2％甲基纤维素浓度的半固体培养基，于细胞培养皿中培养；7-10天后观察培养皿中细胞克隆的大小以及数量，在体式显微镜下挑出至20％胎牛血清的HT培养基中培养2-3天后进行效价检测，在竞争法ELISA质控合格作亚克隆。

作为进一步的优选，所述甲基纤维素半固体培养基包括：DMEM、MEM、2％质量百分比的甲基纤维素、胎牛血清、50×HAT以及L－谷氨酰胺。

一种分泌甲氨蝶呤单抗的杂交瘤细胞株的应用，所述杂交瘤细胞株用于制备抗甲氨蝶呤单克隆抗体，所述单克隆抗体可用于特异性识别甲氨蝶呤。

作为进一步的优选，所述抗甲氨蝶呤单克隆抗体的制备方法包括如下步骤:将所述杂交瘤细胞注射预先用弗氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠，收集所述小鼠的腹水，所述腹水经过预处理后纯化。

作为进一步的优选，所述纯化包括：选用Protein G-琼脂糖亲和层析柱纯化。

本发明的有益效果是：