[发明专利]球孢白僵菌脱乙酰几丁质酶BbCSN在防治植物病原真菌中的用途

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，尤其是涉及球孢白僵菌脱乙酰几丁质酶BbCSN在防治植物病原真菌中的用途。

背景技术

植物病害是严重危害农业生产的自然灾害之一，发生于植物生长的各个时期，各个生长部位，种类繁多，形成危害的因素复杂(张越等,2015)。化学防治是目前农业生产上解决植物病害所采取的主要措施，具有见效快、杀菌谱广、成本低、使用简便等优点(吴金平等,2009)。但是随着时间的推移，化学防治也逐渐的暴露出很多弊端，如长期使用同一类农药造成的定向选择，使防治对象产生抗药性，从而降低或失去防治效果；而且使用不易降解的农药造成粮食、果品、土壤、水域残留量超标，严重污染环境，威胁人类健康；除少数几种农药有选择性外，多数化学农药对害虫及其天敌都有较大的杀伤作用，长期使用此类农药会削弱天敌环。

针对农业方面的这种现状，人们迫切需要寻找一种对人类和环境无害并具有良好防治效果的植物病害防治方法。选育抗病品种是防治植物病害最经济、最有效的途径，人类己利用植物抗病品种控制了多种大范围流行的毁灭性病害。利用抗病品种还可以避免或减轻因过分倚重农药而出现的耐药和环境污染问题，但是这种方法育种年限长。而转基因育种则能够对具体基因进行操作和选择，不受物种的限制，扩大可利用的基因范围，大大地提高植物品种改良的效率(刘珊,2012)。随着生物技术的迅猛发展，转基因技术得到广泛应用，为农作物病害的防治开辟了新的道路。而转基因技术的关键是表达什么基因能够提高植物的抗病能力。

植物病原真菌的细胞壁主要由几丁质、甘露聚糖、葡聚糖等组成。有研究指出，植物病原真菌在侵入植物的过程中，为了躲避植物几丁质酶对胞壁几丁质的降解，会将几丁质转化为脱乙酰几丁质(Kouzaytai Y et al.,2012)。因此，在植物中导入脱乙酰几丁质酶基因，利用脱乙酰几丁质酶对入侵真菌胞壁的降解，可提高植物对对真菌病害的抗性。此外，脱乙酰几丁质酶降解脱乙酰几丁质后产生的脱乙酰几丁质寡聚体，可诱导植物自身的防御反应，比如气孔关闭(Lee S et al.,1999)、木质化作用(Vander P et al.,1998；Moerschbacher B M et al.,1988)、病原相关(PR)基因的表达等(Jabs T et al.,1997)。因此发掘高效降解脱乙酰几丁质的水解酶，利用其提高植物的抗病能力是植物抗病基因工程研究的一个重要领域。球孢白僵菌是一种国内外应用广泛的昆虫病原真菌。除致病昆虫外，球孢白僵菌还是一种重要的植物内生菌，可提高植物的抗病能力。体外实验表明，来自球孢白僵菌的水解酶，如几丁质酶、蛋白酶等被认为与拮抗植物病原真菌的能力相关。

发明内容

本发明要解决的技术问题为防治植物病原真菌提供一种新选择。

本发明提供了球孢白僵菌脱乙酰几丁质酶BbCSN在防治植物病原真菌中的用途。

具体的，所述的球孢白僵菌脱乙酰几丁质酶具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

具体的，所述的球孢白僵菌脱乙酰几丁质酶的编码基因具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

具体的，所述的植物病原真菌为毛霉菌、稻瘟病菌或灰葡萄孢霉。

本发明还提供一种植物病原真菌抑制剂，其主要活性成分为球孢白僵菌脱乙酰几丁质酶BbCSN。

其中，所述的植物病原真菌为毛霉菌、稻瘟病菌或灰葡萄孢霉菌。

本发明还提供了表达球孢白僵菌脱乙酰几丁质酶BbCSN的载体的构建方法，包括如下步骤：

a、设计引物扩增BbCSN，T/A克隆，进行验证；

b、双酶切验证为阳性的转化子和表达载体骨架，然后回收BbCSN片段和载体骨架片段，连接，验证；

c、验证正确的表达载体转入根癌农杆菌。

具体的，步骤a中的引物序列具有如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

本发明的有益效果：本发明公开了一种具有抑制植物病原真菌生长的脱乙酰几丁质酶BbCSN基因，来源于昆虫病原真菌球孢白僵菌。将该BbCSN基因转入烟草后，与野生型烟草叶片总蛋白相比，转基因烟草叶片总蛋白对毛霉及灰葡萄孢霉孢子萌发均有抑制作用，对稻瘟病菌及灰葡萄孢霉菌丝的生长抑制作用较野生型强。本发明为植物病害的防治提供了有效的抗性基因，具有广阔的应用前景。

附图说明