[发明专利]一种胎盘干细胞复合壳聚糖组织修复材料的制备方法

权利要求书

1.一种胎盘干细胞复合壳聚糖组织修复材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：机械剥除胎盘羊膜组织，将剥离后剩下的绒毛组织，过质量浓度75％的酒精，再用PBS冲洗洗尽血渍，并将其剪成1mm²小块后，浸没于含有质量浓度0.1％的IV型胶原酶的低糖基础培养基中，37℃消化15-45分钟,得细胞组织液；

步骤二：细胞组织液经200目筛网过筛后转移至干净的离心管，1200rpm离心lOmin，弃上清液后接种于含有质量浓度10％的胎牛血清的低糖基础培养基中，于37℃、5％CO₂的培养箱中培养5天后进行第一次换液，随后每隔两天进行换液，待细胞融合至90％使用质量浓度0.25％的胰酶进行消化，得胎盘绒毛膜来源间充质干细胞(CMSCs)；

步骤三：称取0.2g壳聚糖，溶于40ml去离子水中，配制质量体积比为20％的壳聚糖溶液，另加入0.32g氯化钠晶体及0.5ml冰醋酸，调节pH至5.0混合搅拌均匀得壳聚糖溶液；

步骤四：称取8g明胶，溶于40m1去离子水中，充分振荡后将溶液置于50℃水浴箱，待溶解后转入培养皿中，放入4℃冰箱，凝固后得固体凝胶；

步骤五：将壳聚糖溶液加入固体凝胶表面，浸泡5-7分钟，然后移出壳聚糖溶液，再加入清水浸泡1分钟，每浸泡一次壳聚糖溶液为1层，共做15层；将固体凝胶取出，放入装有37℃水的容器中，随着明胶基底逐渐熔化，其表面有薄膜析出，即得壳聚糖纳米膜；

步骤六：取生长状况良好的胎盘绒毛膜来源间充质干细胞(CMSCs)接种于壳聚糖纳米膜上，接种时间为2-12h，即得胎盘干细胞复合壳聚糖组织修复材料。

2.根据权利要求1所述的一种胎盘干细胞复合壳聚糖组织修复材料的制备方法，其特征在于，所述的步骤一还包括：将剥离后剩下的绒毛组织制成面积为10cm²。

3.根据权利要求1所述的一种胎盘干细胞复合壳聚糖组织修复材料的制备方法，其特征在于：步骤一中所述的PBS中含有质量浓度0.1％的青-链霉素。

4.根据权利要求1所述的一种胎盘干细胞复合壳聚糖组织修复材料的制备方法，其特征在于，所述的步骤五还包括：将壳聚糖纳米膜冷冻干燥，并置于24孔板中，于放射CO⁶⁰辐射消毒。

5.根据权利要求1所述的一种胎盘干细胞复合壳聚糖组织修复材料的制备方法，其特征在于：所述的步骤五中浸泡均在20℃室内环境下进行。