[发明专利]一种桔霉素亲和蛋白的制备方法

说明书

本发明涉及食品安全检测前处理技术，旨在提供一种桔霉素亲和蛋白的制备方法。包括：取经桔霉素免疫的牛蛙的血清，再加入磷酸缓冲液；以饱和硫酸铵溶液进行分级沉淀，留上清液；加入磷酸缓冲液作为透析液，在4℃透析脱盐；取透析袋中的蛋白质冷冻干燥，收集粉末备用。本发明通过使用含有一定浓度桔霉素的红曲粉添加到牛蛙养殖水中，获得对桔霉素具有亲和作用的低成本的牛蛙血清蛋白，属于开创性研究。大大简化了传统桔霉素抗体的制备方法，极大降低桔霉素免疫亲和柱的成本。本发明所述方法经济、高效、适用范围广。本发明所得蛋白质对桔霉素具有很强的亲和力，在保持相近的回收率同时，具有去除杂质干扰的特点更有优势。

技术领域

本发明涉及食品安全检测前处理技术，具体涉及一种桔霉素亲和蛋白的制备方法。可以使用桔霉素直接免疫牛蛙获得相应血清蛋白，该蛋白可以用于制备桔霉素的纯化柱。

背景技术

桔霉素主要由青霉、曲霉、红曲霉属真菌产生。桔霉素是一种肾毒素，具有致畸致癌性，已经被国际生命科学院自然毒素检测委员会欧洲分会列为必须检测的毒素之一。桔霉素广泛存在于人们日常生活的各类食品中，如由曲霉发酵而成的腐乳、酱油、黄酒类等酿造食品，红曲色素为食品添加剂的肉制品等食品(红曲霉)。学者在红曲色素、谷物、果汁等食品中，均测出桔霉素。欧盟要求食品的桔霉素不得超过0.1mg/kg，韩国的限量标准为0.05mg/kg，澳大利亚、新西兰等国家要求食品的桔霉素不能够超过0.2mg/kg。日本规定红曲色素的桔霉素不能超过0.2mg/kg，我国对以红曲原料为保健食品有桔霉素限量，为0.05mg/kg，但对普通食品还没有设定桔霉素限制标准。我国部分出口食品需要检测桔霉素含量，它已经成了限制我国红曲及其制品，利用曲霉的食品出口的瓶颈问题。

目前桔霉素定量检测方法为食品提取液先经过免疫亲和柱纯化，去除影响检测的杂质后，再用高效液相-荧光检测器(HPLC-FLD)检测。本免疫亲和柱的实现原理是：桔霉素属于半抗原，是只有抗原性而无免疫原性的物质，只有与载体蛋白结合进行免疫才能产生对应抗体。传统免疫亲和柱的制备方法是：将桔霉素先与特定蛋白质偶联反应，合成共价连接的完全抗原，检测偶联程度，去除没有偶联的蛋白质，再免疫兔子、小鼠、大鼠，在获得桔霉素抗体后制作免疫亲和柱。由于需要经历复杂的蛋白质偶联反应、偶联物鉴定、去除未偶联蛋白和未偶联桔霉素。其工序复杂，导致整个程序时间长，桔霉素标品损失大，制作成本高。而发明人通过桔霉素标品对蚕、鸡蛋、牛蛙、小鼠不同动物筛选，发现桔霉素对牛蛙具有超敏特性。牛蛙是我国普遍养殖的食用蛙类。可以从市场购买牛蛙，养殖在具有一定浓度的桔霉素的环境中，养殖一定时间，其自动获得免疫，产生桔霉素亲和蛋白或抗体。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种桔霉素亲和蛋白的制备方法。

为解决技术问题，本发明的解决方案是：

提供一种桔霉素亲和蛋白的制备方法，包括以下步骤：

取经桔霉素免疫的牛蛙的血清20mL至容器中，再加入20mL的0.01M、pH7.4的磷酸缓冲液(PBS)；将容器置于于冰上，用玻璃棒搅拌混匀；在搅拌同时滴加饱和硫酸铵溶液40mL，使混合物中硫酸铵的最终质量浓度为50％；在4℃冰箱中静置3h后，在8000r/min和4℃条件下离心30min，弃上清液；

沉淀用20mL的0.01M、pH 7.4的磷酸缓冲液溶解后，在搅拌同时滴加饱和硫酸铵溶液13.33mL，使混合物中硫酸铵的最终质量浓度为40％；在4℃冰箱中静置1h后，在8000r/min和4℃条件下离心30min，弃上清液；

沉淀用20mL的0.01M、pH 7.4的磷酸缓冲液溶解后，在搅拌同时滴加饱和硫酸铵溶液9.85mL，使混合物中硫酸铵的最终质量浓度为33％；在4℃冰箱中静置1h后，在8000r/min和4℃条件下离心30min，留上清液，去沉淀；