[发明专利]一种以植物表皮作为组织工程支架材料的细胞培养方法

说明书

本发明公开了一种以植物表皮作为组织工程支架材料的细胞培养方法，以洋葱鳞茎内表皮等植物表皮作为支架材料，具有无毒、免疫原性小，生物相容性好，透明度高，具有一定的机械强度，可塑性好，价格低廉，易取材等优点，细胞在植物表皮上的增殖速度与现有支架材料相近，且角膜上皮细胞能够在植物表皮上形成上皮样结构，细胞排列紧密，说明植物表皮为细胞提供了良好的增殖和分化基础，优于现有的组织工程支架材料。

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种以植物表皮作为组织工程支架材料的细胞培养方法。

背景技术

组织工程材料是组织工程的基础，构建组织工程的支架材料可以为细胞提供增殖和分化的基础，支架材料的特性决定了构建成的组织的形态。近年来，人们一直在寻找具有良好生物相容性、机械性能较好、透光性强的适合作为构建组织工程角膜的支架材料。目前使用的支架材料主要有生物、人工合成、复合材料，另外还有免支架的培养方法。使用最成熟的材料为羊膜，但羊膜的使用存在处理不当和传播疾病的风险；胶原是应用眼表重建的天然可降解材料，但其稳定性差、降解快限制了它的发展；壳聚糖是另一种天然支架材料，由于壳聚糖大分子具有稳定的环状结构，存在较强的氢键相互作用，溶解性差，所以在组织工程支架材料中应用也较少。人工合成的高分子材料如聚乳酸(PLA)和聚羟基乙酸(PGA)具有良好的生物相容性，可以发生非酶性水解，但是亲水性较差，体内代谢过程不完全清楚，可引起炎症反应、局部酸性产物堆积等，要作为组织工程角膜的支架材料，还需要深入研究。总之，目前的生物材料组织相容性好，但是可塑性不佳；人工合成材料的机械性能好，但会有细胞毒性；复合材料集合了生物材料和人工合成材料的优点，但其产生的新特性尚需进一步研究。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种以植物表皮作为组织工程支架材料的细胞培养方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种以植物表皮作为组织工程支架材料的细胞培养方法，从植物上分离出膜状的具有单层细胞结构的植物表皮，将细胞接种于铺展开的该植物表皮上进行培养。所述植物表皮可以来源于多种植物，只要易于分离成单层细胞结构的膜状，且具有一定的物理强度及韧性，符合组织工程材料的要求即可。例如百合科葱属植物，多具有鳞茎，如洋葱、大葱等，较易分离得到符合要求的表皮。

一实施例中：从植物上分离出膜状的具有单层细胞结构的植物表皮，消毒灭菌；然后将植物表皮铺展固定在已去除了膜的细胞培养小室底部，得到植物表皮支架；将细胞接种于该植物表皮支架上进行培养。

一实施例中：将所述植物表皮支架置于培养基中，将细胞接种于该植物表皮支架上，进行培养；在细胞融合率小于100％时，采用浸没培养法，每隔1～3天换液；当细胞融合率至100％时，改用气液界面培养法培养。

一实施例中：所述气液界面培养法为：将植物表皮支架置于培养孔板中，在每个植物表皮支架中加入培养基，另在培养孔板中每孔加入培养基，并使植物表皮处于气液界面处；每隔1～3天换液。

一实施例中：所述细胞接种量为3～8×10⁴个/cm²。

一实施例中：所述细胞为角膜上皮细胞。

一实施例中：所述角膜上皮细胞为原代角膜上皮细胞，其制备方法如下：

a)冲洗干净待取材的动物结膜囊，取角膜，漂洗后放入培养基中；除去角膜上带有的结膜及巩膜部分；

b)将步骤a)得到的角膜浸没于含有1.5～2.5mg/mL Dispase II的培养基中，0～5℃下消化12～18h，以分离出角膜上皮片；

c)消化结束后，分离角膜上皮片，并将其用0.2～0.3％胰酶在35～38℃消化10～25min，终止消化，混合均匀，离心，去除上清，沉淀用培养基混合均匀，得到角膜上皮细胞液，用于接种在所述植物表皮支架上。