[发明专利]一种以植物表皮作为组织工程支架材料的细胞培养方法

权利要求书

1.一种以植物表皮作为组织工程支架材料的细胞培养方法，其特征在于：从植物上分离出膜状的具有单层细胞结构的植物表皮，将细胞接种于铺展开的该植物表皮上进行培养；所述植物表皮为洋葱鳞茎内表皮。

2.根据权利要求1所述的以植物表皮作为组织工程支架材料的细胞培养方法，其特征在于：从植物上分离出膜状的具有单层细胞结构的植物表皮，消毒灭菌；然后将植物表皮铺展固定在已去除了膜的细胞培养小室底部，得到植物表皮支架；将细胞接种于该植物表皮支架上进行培养。

3.根据权利要求2所述的以植物表皮作为组织工程支架材料的细胞培养方法，其特征在于：将所述植物表皮支架置于培养基中，将细胞接种于该植物表皮支架上进行培养；在细胞融合率小于100％时，采用浸没培养法，每隔1～3天换液；当细胞融合率至100％时，改用气液界面培养法培养。

4.根据权利要求3所述的以植物表皮作为组织工程支架材料的细胞培养方法，其特征在于：所述气液界面培养法为：将植物表皮支架置于培养孔板中，在每个植物表皮支架中加入培养基，另在培养孔板中每孔加入培养基，并使植物表皮处于气液界面处；每隔1～3天换液。

5.根据权利要求4所述的以植物表皮作为组织工程支架材料的细胞培养方法，其特征在于：所述细胞接种量为3～8×10⁴个/cm²。

6.根据权利要求5所述的以植物表皮作为组织工程支架材料的细胞培养方法，其特征在于：所述细胞为角膜上皮细胞。

7.根据权利要求6所述的以植物表皮作为组织工程支架材料的细胞培养方法，其特征在于：所述角膜上皮细胞为原代角膜上皮细胞，其制备方法如下：

a)冲洗干净待取材的动物结膜囊，取角膜，漂洗后放入培养基中；除去角膜上带有的结膜及巩膜部分；

b)将步骤a)得到的角膜浸没于含有1.5～2.5mg/mL Dispase II的培养基中，0～5℃下消化12～18h，以分离出角膜上皮片；

c)消化结束后，分离角膜上皮片，并将其用0.2～0.3％胰酶在35～38℃消化10～25min，终止消化，混合均匀，离心，去除上清，沉淀用培养基混合均匀，得到角膜上皮细胞液，用于接种在所述植物表皮支架上。

8.根据权利要求6所述的以植物表皮作为组织工程支架材料的细胞培养方法，其特征在于：所述培养基为SHEM培养基。

9.根据权利要求5所述的以植物表皮作为组织工程支架材料的细胞培养方法，其特征在于：所述细胞为原代角膜基质细胞、乳腺癌细胞、小鼠成纤维细胞、人角膜上皮细胞系、人脐静脉内皮细胞系。