[发明专利]基于苝酰亚胺多臂聚合物的蛋白质生物发光成像传感器

权利要求书

1.一种基于苝酰亚胺多臂聚合物的蛋白质生物发光成像传感器，其特征在于，所述蛋白质生物发光成像传感器为BRET受体、BRET供体萤光素酶及萤光素酶底物，所述BRET受体为苝酰亚胺多臂聚合物；所述苝酰亚胺多臂聚合物结构如通式所示，n为10-20的整数；R独立为、、、、或；其中当R为时将苝酰亚胺多臂聚合物命名为P1，其中当R为，将苝酰亚胺多臂聚合物命名为P2，其中当R为时将苝酰亚胺多臂聚合物命名为P3，其中当R为时将苝酰亚胺多臂聚合物命名为P4，其中当R为时将苝酰亚胺多臂聚合物命名为P5，其中当R为时将苝酰亚胺多臂聚合物命名为P6；

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2.如权利要求1所述的传感器，其特征在于，所述BRET供体萤光素酶是萤火虫萤光素酶，所述萤光素酶底物是D-荧光素。

3.如权利要求1所述的传感器，其特征在于，所述苝酰亚胺多臂聚合物P1-P6的制备方法为如下步骤：1当量诱发剂N，N'-二（2,6-二异丙基苯基）-1,6,7,12-四[4-（2-溴异丁酸乙酯）苯氧基]苝-3,4,9,10-四羧酸二酰亚胺中加入400当量对应氨基酸修饰的单体，2000当量丁酮，1000当量甲醇和1000当量水；反应容器用冷冻解冻泵循环法脱气3次，加入80当量五甲基二乙烯基三胺和28当量溴化亚铜；氮气保护，18-25℃下搅拌10分钟后，60℃聚合反应过夜后用液氮猝熄反应，溶液倒入过量乙醚中沉淀聚合物，除去乙醚液，将沉淀溶于水中并透析3天后冷冻干燥，得苝酰亚胺多臂聚合物P1至P6，所述氨基酸修饰的单体分别为苯丙氨酸单体、丝氨酸单体、天冬氨酸单体、亮氨酸单体、组氨酸单体、或组氨酸甲酯单体。

4.如权利要求1所述的传感器，其特征在于，萤光素酶的终浓度为500nM，苝酰亚胺多臂聚合物P1,P2,P3,P4,P5和P6的终浓度分别为500nM,50nM,50nM,250nM,167nM和100nM，萤光素酶底物浓度为0.04M。

5.利用权利要求1所述的蛋白质生物发光成像传感器检测蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（1）构建传感单元，所述传感单元为BRET受体苝酰亚胺多臂聚合物和BRET供体萤光素酶，采用滴定法确定BRET受体与BRET供体萤光素酶的化学计量比例，使萤光素酶浓度一定，逐渐增大聚合物浓度，记录BRET效率变化情况，当曲线趋于平稳不再上升时，取BRET效率最大值时BRET受体与BRET供体萤光素酶的化学计量比例构建传感单元，按检测所需构建传感单元数量；不同苝酰亚胺多臂聚合物构成不同种类的传感单元；

（2）将已知蛋白和未知蛋白都稀释至同一水平，分别各加入到不同传感单元中孵育20~40min，加入已知蛋白的构建为训练集，加入未知蛋白的构建为测试集；

（3）分别在训练集和测试集中加入终浓度为0.04M的萤光素酶底物，通过小动物生物发光成像仪检测BRET信号变化，其检测波长为555nm和610nm；

（4）采用统计软件选择分析方法对步骤（3）得到BRET信号变化数据进行分析，计算测试集未知蛋白与训练集已知蛋白的马氏距离的平方值，未知蛋白归类为与已知蛋白马氏距离的平方值最小的那种蛋白。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，还包括检测步骤（5）由稀释水平计算得未知蛋白的初始浓度。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（1）中所述BRET供体萤光素酶是萤火虫萤光素酶，所述BRET受体苝酰亚胺多臂聚合物为P1至P6中的任意一种，所述传感单元中萤光素酶的终浓度为500nM，所述苝酰亚胺多臂聚合物P1,P2,P3,P4,P5和P6对应的终浓度分别为500nM,50nM,50nM,250nM,167nM和100nM。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述BRET信号变化，简称BR，计算方式如下：

其中，R为加入蛋白质时受体发光强度与供体发光强度的比值，R₀为未加入蛋白质时受体发光强度与供体发光强度的比值。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述传感单元体系为pH7.8的0.01M磷酸钠缓冲液，所述同一水平是蛋白在280nm下的紫外吸收值均为0.005。