[发明专利]基于RCN2标志物检测的心血管病检测方法及试剂盒

权利要求书

1.一种基于RCN2标志物检测的心血管病检测方法，其特征在于，其通过检测RCN2浓度水平从而检测心血管病。

2.根据权利要求1所述的基于RCN2标志物检测的心血管病检测方法，其特征在于，其利用亲和素-生物素结合ELISA的方法检测RCN2浓度水平从而检测心血管病。

3.根据权利要求2所述的基于RCN2标志物检测的心血管病检测方法，其特征在于，其包括如下步骤：

步骤S111包被抗体：包被缓冲液将RCN2特异性抗体稀释固著于ELISA微孔板上；

步骤S112加入样本：将待测样品与标准蛋白稀释后加至ELISA酶标板孔中，25~40℃孵育1-2小时；

步骤S113加入检测抗体：分别加入生物素标记的RCN2特异抗体，25~40℃孵育1-2小时后，洗涤液洗涤1~5次，每次1~5min；

步骤S114引入酶标：分别加入亲和素交联辣根过氧化物酶结合物，25~40℃孵育1-2小时后，洗涤液洗涤1~5次，每次1~5min；

步骤S115底物反应：分别加入显色底物显色15~30min，加入终止液中止反应；

步骤S116检测：使用酶标仪在450nm处测定样品吸光度，计算出RCN2浓度；

步骤S117结果判断：当RCN2浓度水平为小于20ng/ml，样品所属人体为健康个体，当RCN2浓度水平为大于20ng/ml，样品所属人体为高患病风险个体。

4.一种基于RCN2标志物检测的心血管病检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒是ELISA检测试剂盒，包括：包被有RCN2抗体的ELISA酶标板、检测RCN2抗原的抗体、酶结合物、标准蛋白、样品稀释液、包被缓冲液、封闭液、酶标板洗涤液、显色液和终止液。

5.根据权利要求4所述的基于RCN2标志物检测的心血管病检测试剂盒，其特征在于，所述的ELISA检测试剂盒中：

所述的酶标板包被抗体为鼠抗人RCN2单克隆抗体；

所述的检测抗体是生物素标记的兔抗人RCN2抗体；

所述的酶结合物是亲和素交联辣根过氧化物酶结合物；

所述的标准蛋白是重组人RCN2蛋白；

所述的包被缓冲液是1×PBS，pH：7.4；

所述的封闭液是5%牛血清白蛋白+PBS溶液的封闭液；

所述的酶标板洗涤液是含0.25%Tween-20的1×PBS溶液；

所述的样品稀释液是1×PBS；

所述的显色液是3,3',5,5'-四甲基联苯胺；

所述的终止液是2mol/L的硫酸溶液。

6.根据权利要求4所述的基于RCN2标志物检测的心血管病检测试剂盒，其特征在于，其所使用的检测方法包括以下步骤：

步骤S111包被抗体：包被缓冲液将RCN2特异性抗体稀释，在ELISA酶标板的每孔中加入100ul，封板后置于4℃孵育过夜，备用；

步骤S112加入样本：将待检样本用样品稀释液以一定比例稀释，以100ul/孔的体积加样；标准蛋白用样品稀释液稀释成不同浓度梯度，以100ul/孔的体积加样，37℃孵育2小时；

步骤S113加入检测抗体：弃去孔内样本，加入生物素标记的RCN2特异抗体，每孔100ul，37℃孵育1小时后，弃去孔内抗体，加入洗涤液洗涤3次，每孔300ul，每次2min，甩干；

步骤S114引入酶标：加入亲和素交联辣根过氧化物酶结合物，37℃孵育1小时后，弃去孔内抗体，加入洗涤液洗涤5次，每孔300ul，每次2min，甩干；

步骤S115底物反应：加入TMB显色底物，每孔90ul，显色20min后，每孔加入50ul终止液中止反应；

步骤S116检测：使用酶标仪在450nm处测定样品吸光度，校正波长为540nm或者570nm，计算出RCN2浓度。

7.一种如权利要求4至6任一所述的基于RCN2标志物检测的心血管病检测试剂盒在心血管诊断中的应用。

8.根据权利要求7所述的基于RCN2标志物检测的心血管病检测试剂盒在心血管诊断中的应用，其特征在于，所述的心血管病包括冠心病（CHD）、周围动脉疾病（PAD）。

9.根据权利要求8所述的基于RCN2标志物检测的心血管病检测试剂盒在心血管诊断中的应用，健康人RCN2浓度水平为小于20ng/ml，当大于20ng/ml时，则代表具有较高患病风险。