[发明专利]长牡蛎胞壁水解酶重组蛋白的制备及制备获得的重组蛋白的应用

说明书

本发明属于分子生物学和生物化学技术领域，具体涉及一种来自长牡蛎胞壁水解酶重组蛋白的制备及制备获得的重组蛋白的应用。利用酵母表达体系获得长牡蛎胞壁水解酶的重组蛋白。本发明利用酵母表达体系获得了长牡蛎胞壁水解酶的重组蛋白对大肠杆菌、嗜水气单胞菌、金黄色葡萄球菌、灿烂弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌、恶臭假单胞菌和铜绿假单胞菌的生长具有显著的抑制作用。本发明获得的重组蛋白可用于抑菌剂开发。

技术领域

本发明属于分子生物学和生物化学技术领域，具体涉及一种来自长牡蛎胞壁水解酶重组蛋白的制备及制备获得的重组蛋白的应用。

背景技术

长牡蛎是世界重要的海水养殖贝类之一，在我国水产养殖经济中长期占据举足轻重的地位。近年来，由各种病原微生物引起的疾病在长牡蛎的养殖群体中不断爆发，对养殖产业造成了巨大损失。因此，对长牡蛎开展免疫防御机制研究，发掘有效的抗病相关功能蛋白将有助于人类对其病害进行有效防控。

长牡蛎隶属于软体动物，缺乏适应性免疫系统，仅依赖固有免疫系统抵御病原入侵。抗菌肽/蛋白作为固有免疫中重要效应分子，直接参与了对病原微生物的杀伤和清除过程。通过生物信息学技术分析发现，长牡蛎基因组序列编码了若干个胞壁水解酶基因。其中，CgCLE-1(Genbank注册号：XP_011436111.1)基因开放阅读框为501bp，其编码的蛋白含有一段120个氨基酸的Hydrolase_2结构域。CgCLE-1氨基酸序列除与长牡蛎中其他胞壁水解酶序列一致性为55-99％，与梭状芽孢杆菌属Clostridium、芽孢杆菌属Bacillus细菌的细胞壁水解酶(cell wall hydrolase)或孢子皮质裂解酶(spore cortex-lytic enzyme)一致性约为30-40％。目前，国内外对细菌来源的胞壁水解酶进行了功能研究，发现其可特异性地降解孢子皮质中的肽聚糖，在孢子萌发过程发挥重要作用。但对无脊椎动物胞壁水解酶的制备、功能及其应用的研究尚未见报道。本发明利用酵母表达体系制备长牡蛎胞壁水解酶CgCLE-1重组蛋白，并对制备获得的重组蛋白进行抑菌功能研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种来自长牡蛎胞壁水解酶重组蛋白的制备及制备获得的重组蛋白的应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种长牡蛎胞壁水解酶重组蛋白的制备，利用酵母表达体系获得长牡蛎胞壁水解酶的重组蛋白。

具体为：

1)通过长牡蛎血淋巴细胞总RNA，反转获得cDNA；

2)在CgCLE-1的Hydolase_2结构域编码区两端分别设计含有限制性酶切位点的引物；

序列为：5’-GAATTCAGAGGAGAACCGATGGAAGCTA-3’，5’-GCGGCCGCCACAAAGTACAGACCCCCGAGTT-3’；

3)以步骤1)获得cDNA为模板，采用步骤2)的引物通过PCR扩增获得该基因片段，并将其克隆到pPICZαA表达载体中构建重组质粒；

4)所述获得重组质粒经ScaI线性化后，电转入宿主细胞毕赤酵母Pichiapastoris GS115中实现真核体外重组表达，而后纯化获得CgCLE-1重组蛋白。

一种利用制备方法获得长牡蛎胞壁水解酶重组蛋白的应用，所述长牡蛎Crassostrea gigas胞壁水解酶(CgCLE-1)的重组蛋白作为抑菌剂的应用。

所述长牡蛎Crassostrea gigas胞壁水解酶(CgCLE-1)的重组蛋白作为大肠杆菌、嗜水气单胞菌、金黄色葡萄球菌、灿烂弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌、恶臭假单胞菌或铜绿假单胞菌的抑菌剂的应用。

本发明所具有的优点: