[发明专利]一种提取大型真菌基因组DNA的方法

权利要求书

1.一种提取大型真菌基因组DNA的方法，包括以下步骤：

1)破碎细胞

将大型真菌的子实体或菌丝在液氮中研磨，研磨结束后加入试剂Ⅰ，震荡，水浴，离心，取上清液；

其中，所述的试剂I中各组分及含量为：Tris-HCl 100～400mM，NaCl 100～400mM，EDTA 10～40mM，SDS细胞裂解液0.3～0.6wt.％，乙烯聚吡咯烷酮0.1～1wt.％，pH＝7.7～8.0；

2)去除蛋白质、抽提基因组DNA

向步骤1)的上清液中加入试剂Ⅱ，混匀，离心，取上清液；

其中，所述试剂Ⅱ中按体积比含有：苯酚：氯仿：异戊醇＝25：20～24：1～2；

3)沉淀、溶解基因组DNA

加入异丙醇，混匀，离心，舍弃上清，保留沉淀，再加入试剂Ⅲ，混匀，然后加入试剂Ⅳ，溶解所提取的DNA，混匀；

其中，所述试剂Ⅲ为灭菌蒸馏水或1×TE缓冲液；试剂Ⅳ中含有：异硫氰酸胍6～10M，Tris-HCl 20～60mM，EDTA 30～60mM，聚乙二醇辛基苯基醚10～40mM；

4)纯化基因组DNA

将步骤3)的混合液移入核酸吸附柱中，静置，离心，提取物吸附至核酸吸附柱，弃滤液；向核酸纯化柱中加入试剂Ⅴ，离心，弃去滤液，再加试剂Ⅵ，离心，弃去滤液；

其中，所述的试剂Ⅴ包括异硫氰酸胍6～10M，Tris-HCl 20～60mM；试剂Ⅵ包括；Tris-HCl 20～60mM，NaCl 100～400mM，乙醇70～75vol％；

5)洗脱基因组DNA

将核酸纯化柱安置于离心管内，离心，向核酸纯化柱中加入试剂Ⅲ，静置，离心，获得所述大型真菌基因组DNA。

2.根据权利要求1所述提取大型真菌基因组DNA的方法，其特征在于，步骤1)中，破碎细胞时，水浴温度为60～65℃。

3.根据权利要求1所述提取大型真菌基因组DNA的方法，其特征在于，步骤1)中，所述试剂Ⅰ包括：Tris-HCl 200～300mM，NaCl 200～300mM，EDTA 20～30mM，SDS细胞裂解液0.4～0.5wt.％，乙烯聚吡咯烷酮0.4～0.6wt.％，pH＝7.7～8.0。

4.根据权利要求1所述提取大型真菌基因组DNA的方法，其特征在于，步骤2)中，所述试剂Ⅱ中按体积比含有苯酚：氯仿：异戊醇＝25：24：1。

5.根据权利要求1所述提取大型真菌基因组DNA的方法，其特征在于，步骤3)中，所述试剂Ⅳ包括：异硫氰酸胍7～9M，Tris-HCl 30～50mM，EDTA 40～50mM，聚乙二醇辛基苯基醚20～30mM。

6.根据权利要求1～5任一项所述提取大型真菌基因组DNA的方法，其特征在于，步骤4)中，所述的核酸纯化柱是含有聚丙烯膜的核酸纯化柱，孔径为0.8～1.2μm。

7.根据权利要求1所述提取大型真菌基因组DNA的方法，其特征在于，步骤4)中，所述试剂Ⅴ包括：异硫氰酸胍7～9M，Tris-HCl 30～50mM；试剂Ⅵ包括：Tris-HCl 30～50mM，NaCl 200～300mM，乙醇70～75vol％。

8.根据权利要求1所述提取大型真菌基因组DNA的方法，其特征在于，步骤5)中，洗脱基因组DNA时，所述试剂Ⅲ的温度为60～65℃。

9.根据权利要求1～8任一项所述提取大型真菌基因组DNA的方法，其特征在于，所述真菌子实体的质量为100～200mg，真菌子实体和试剂I的质量体积比为1：5～6，mg/μl；或者真菌菌丝的质量为20～50mg，真菌菌丝和试剂I的质量体积比为1：30～40，mg/μl。

10.根据权利要求1～9任一项所述提取大型真菌基因组DNA的方法，其特征在于，所述试剂I、试剂II、异丙醇、试剂III、试剂IV、试剂V和试剂VI之间的体积比为1：1～1.5：0.3～0.5：0.1～0.2：0.5～1：0.1～0.2：0.1～0.2。