[发明专利]一种邻苯二醛衍生物亚磷酰胺单体、合成方法及DNA快速偶联蛋白质的方法

说明书

一种邻苯二醛衍生物亚磷酰胺单体、合成方法和及DNA快速偶联蛋白质的方法，涉及DNA快速偶联蛋白质。所述邻苯二醛衍生物亚磷酰胺单体的分子式为C₂₈H₄₆N₃O₆P。首先邻苯二醛羧酸衍生物(OPA‑COOH)与6‑氨基‑1‑己醇反应制备邻苯二醛羟基衍生物(OPA‑OH)，然后在氮气保护及二氯甲烷溶剂和N，N‑二异丙基乙胺条件下，与2‑氰乙基‑N，N‑二异丙基氯代亚磷酰胺室温条件下反应2h，经硅胶柱层析分离，得到邻苯二醛衍生物亚磷酰胺单体。利用邻苯二醛衍生物的相邻醛基能够与蛋白质赖氨酸残基上的氨基进行快速、高效生成苄甲内酰胺的反应特点，最终实现OPA‑DNA与天然蛋白质快速偶联的目的。与其他偶联方法相比，该方法具有选择性、快速、高效的优点。

技术领域

本发明涉及一种邻苯二醛衍生物亚磷酰胺单体及其合成方法，尤其涉及DNA与蛋白质快速偶联的方法。

背景技术

天然蛋白质的修饰，对于生物分析研究领域具有非常重要的意义。比如，在生物传感器方面，通常需要DNA与蛋白质的偶联。传统的DNA与蛋白质的偶联方法，主要分为两类，即非共价偶联和共价偶联。通过生物素和链霉亲和素的非共价结合时最为常见的非共价偶联方式，由于二者非常强的非共价结合能力而被广泛应用于生物分析领域，如酶联免疫吸附测定(ELISA)。然而，上述偶联体系比较繁琐，需要借助于分子量比较大的链霉亲和素，且修饰步骤复杂、耗时，一定程度上限制了其应用。常见的DNA与蛋白质的共价偶联方法包括(1)巯基修饰的DNA(SH-DNA)通过4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(sulfo-SMCC)或M-马来酰亚胺苯甲酸琥珀酰亚胺酯(sulfo-MBS)和蛋白质上的氨基进行偶联；(2)氨基修饰的DNA(NH₂-DNA)通过sulfo-SMCC或sulfo-MBS和蛋白质上的巯基进行偶联；(3)NH₂-DNA通过辛二酸二琥珀酰亚胺酯(DSS)和蛋白质上的氨基进行偶联；(4)NH₂-DNA通过1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)及N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐(sulfo-NHS)和蛋白质上的羧基进行偶联；(5)NH₂-DNA通过戊二醛和蛋白质上的氨基进行偶联(1、Greg T.Hermanson，Bioconjugate Techniques[B].USA,PierceBiotechnology&Thermo Fisher Scientific,2008,1-1202)。然而，上述共价偶联方法，所需时间较长，或操作处理繁琐，而且大部分偶联效率较低。如何实现快速、高效的DNA与蛋白质的共价偶联仍是亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的是针对现有的DNA与蛋白质共价偶联的难题，提供一种DNA修饰单体及其合成方法，以及提供一种DNA与蛋白质选择性、快速、高效偶联的方法。

本发明的技术方案如下：

一种邻苯二醛衍生物亚磷酰胺单体，其分子式为C₂₈H₄₆N₃O₆P，其结构式如下：

本发明的又一技术方案为：

一种邻苯二醛衍生物亚磷酰胺单体的合成方法，包括以下步骤：

1)将邻苯二醛羧酸衍生物(OPA-COOH)、6-氨基-1-己醇、二环己基碳二亚胺(DCC)、1-羟基苯并三氮唑(HOBT)按照摩尔1:1.5-2.5：1-2:1-2混合，抽排除去空气，加入溶剂四氢呋喃搅拌反应而后过滤除去沉淀，再用硅胶柱层析分离纯化，得到邻苯二醛羟基衍生物(OPA-OH)；反应的时间可为12～24h；