[发明专利]高效液相色谱串联质谱检测血清中五种游离型胆汁酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及胆汁酸的检测领域，尤其涉及一种高效液相色谱串联质谱检测五种游离型胆汁酸的方法。

背景技术

胆汁酸(bile acid)，为胆汁的主要有机成分，是一类24碳胆烷酸羟基衍生物的总称。胆汁酸按结构可分为：游离型胆汁酸(free bile acid)和结合型胆汁酸(conjugated bile acid)。人体中游离胆汁酸按其生成部位及结构不同分为初级和次级胆汁酸。初级胆汁酸由肝内胆固醇转变而来，通过一系列反应，最终生成胆酸(cholic acid，CA)、鹅脱氧胆酸(chenodeoxycholic aic，CDCA)。初级胆汁酸在肝细胞合成后，在肝细胞毛细胆管膜一系列转运蛋白以胆盐形式进入毛细胆管，存储于胆囊，进食后胆囊收缩，胆囊排空，胆汁酸进入肠道。在肠道中受细菌作用，初级胆汁酸经过水解、氧化和核羟基的差向异构生成的胆汁酸，称为次级胆汁酸，包括脱氧胆酸(deoxycholic acid，DCA)、石胆酸(lithocholic acid，LCA)和熊脱氧胆酸(ursodeoxycholic acid，UDCA)。

游离型胆汁酸是胆固醇的代谢产物，体内存在多种复杂机制调节游离型胆汁酸的代谢。游离型胆汁酸在脂肪代谢中起着重要作用。游离型胆汁酸主要存在于肝肠循环系统，并通过再循环以达到对人体机体的保护作用。同时，游离型胆汁酸还是FXR、PXR、VDR和GPCR等许多受体的天然配体，调节其代谢相关的酶类和转运蛋白基因的表达，通过调节游离型胆汁酸的水平，能够激活肝脏和胃肠道细胞中相应受体和细胞信号传导通路，从而改变和编码调控葡萄糖、脂肪酸和脂蛋白质的合成、代谢、运输以及能量代谢的相关酶的基因表达。正因为具有如此还总要的生理功能，因此检测检测每一种游离型胆汁酸的体内水平，对于肝胆和肠道疾病的筛查、诊断和鉴别诊断具有重要价值。

分离和定量游离型胆汁酸及其结合物是一项挑战，因为这类化合物的生化特征各异，有的还存在同分异构体，且它们在人体中的含量较低。目前常规检测方法是循环酶法测定生理溶液中的胆汁酸，虽然操作较为简单，然而该方法只能检测总胆汁酸含量，无法做到测定不同游离型胆汁酸的差异；气相色谱和气质联用在检测胆汁酸时需要复杂的样品制备才能进行分析；高效液相色谱串联紫外检测器在检测复杂生物基质中的胆汁酸会导致灵敏度和特异性不足。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种高效液相色谱串联质谱检测血清中五种游离型胆汁酸的方法，其能解决现有技术中游离型胆汁酸检测操作复杂，灵敏度和特异性不足的问题。

本发明的目的采用以下技术方案实现：

高效液相色谱串联质谱检测血清中五种游离型胆汁酸的方法，所述五种游离型胆汁酸为：胆酸，石胆酸，脱氧胆酸，熊脱氧胆酸，鹅脱氧胆酸；

包括如下步骤：

(1)标准品的制备：将上述五种游离型胆汁酸标准品用乙腈稀释到若干个不同浓度备用，每个浓度的标准品中加入等量的含有已知浓度内标的乙腈溶液；所述游离型胆汁酸乙腈溶液的浓度均控制在400pmol/L～2μmol/L之间，所述内标为氘代胆酸、氘代脱氧胆酸、氘代熊脱氧胆酸，高速离心后吸取上清液，进行冻干后，加入一定量的含有乙腈的水溶液后离心，取上清液于96孔板用于高通量液相色谱串联质谱上样分析；

(2)高效液相色谱分离：利用超高压液相色谱以及相应的流动相，在反向C18分析柱上对五种游离型胆汁酸进行分离；

(3)串联质谱检测：色谱上分离后的五种游离型胆汁酸进入到质谱进行检测，利用三重四级杆质谱中的多重反应监控模式特异性地检测五种游离型胆汁酸，根据信号噪音比计算得到定量检测限与鉴定检测限，根据比值以及已知标准品和内标浓度值绘制标准曲线图并得到定量校正方程；

(4)血清中游离型胆汁酸的检测：取血清样本，加入含内标的乙腈溶液进行蛋白沉淀，充分沉淀后第一次离心，移取血清上清液利用离心浓缩冷冻系统冻干后，加入一定量的含有乙腈的水溶液后离心，取上清液于96孔板上备用，用于高效液相色谱串联质谱上样分析；

高效液相色谱串联质谱上样分析步骤同步骤(2)、步骤(3)，液相色谱质谱检测得到游离型胆汁酸与内标的比值，将比值代入到定量校正方程，计算得到血清中游离型胆汁酸的含量。

进一步，所述步骤(1)中所述含已知浓度内标的乙腈溶液为，所述内标为氘代胆酸的浓度为76nmol/L，内标氘代脱氧胆酸的浓度为104nmol/L，内标氘代熊脱氧胆酸的浓度为126nmol/L。