[发明专利]高效液相色谱串联质谱检测血清中五种游离型胆汁酸的方法

权利要求书

1.高效液相色谱串联质谱检测血清中五种游离型胆汁酸的方法，其特征在于，所述五种游离型胆汁酸为：胆酸，石胆酸，脱氧胆酸，熊脱氧胆酸，鹅脱氧胆酸；

包括如下步骤：

(1)标准品的制备：将上述五种游离型胆汁酸标准品用乙腈稀释到若干个不同浓度备用，每个浓度的标准品中加入等量的含有已知浓度内标的乙腈溶液；所述游离型胆汁酸乙腈溶液的浓度均控制在400pmol/L～2μmol/L之间，所述内标为氘代胆酸、氘代脱氧胆酸、氘代熊脱氧胆酸，离心后吸取上清液，进行冻干后，加入一定量的含有乙腈的水溶液后离心，取上清液于96孔板用于高效液相色谱串联质谱上样分析；

(2)高效液相色谱分离：利用超高压液相色谱以及相应的流动相，在反向C18分析柱上对五种游离型胆汁酸进行分离；

(3)串联质谱检测：色谱上分离后的五种游离型胆汁酸进入到质谱进行检测，利用三重四级杆质谱中的多重反应监控模式特异性地检测五种游离型胆汁酸，根据信号噪音比计算得到定量检测限与鉴定检测限，根据比值以及已知标准品和内标浓度值绘制标准曲线图并得到定量校正方程；

(4)血清中游离型胆汁酸的检测：取血清样本，加入含内标的乙腈溶液进行蛋白沉淀，充分沉淀后第一次离心，移取血清上清液利用离心浓缩冷冻系统冻干后，加入一定量的含有乙腈的水溶液后离心，取上清液于96孔板上备用，用于高效液相色谱串联质谱上样分析；

高效液相色谱串联质谱上样分析步骤同步骤(2)、步骤(3)，液相色谱质谱检测得到游离型胆汁酸与内标的比值，将比值代入到定量校正方程，计算得到血清中游离型胆汁酸的含量。

2.根据权利要求1中所述高效液相色谱串联质谱检测血清中五种游离型胆汁酸的方法，其特征在于，步骤(1)中所述含已知浓度内标的乙腈溶液为，所述内标氘代胆酸的浓度为76nmol/L，内标氘代脱氧胆酸的浓度为104nmol/L，内标氘代熊脱氧胆酸的浓度为126nmol/L。

3.根据权利要求1中所述高通量液相色谱串联质谱检测血清中五种游离型胆汁酸的方法，其特征在于，所述步骤(2)中高通量液相色谱分离条件为：色谱柱：Waters ACQUITY UPLCC18Column:pore sizeparticle size 1.7μm,2.1mm×50mm；cat.#186002350IVD；色谱柱柱温：45℃；进样量：10μL；流速：0.4mL/min；流动相组成：A相为0.1％甲酸水溶液，B相为0.1％甲酸-乙腈：甲醇＝3：1的溶液；采用梯度洗脱方式，见表1或表2；

表1

表2

序号 时间(min) 流速(mL/min) A％ B％ 曲线值 1 - 0.4 65 35 - 2 2.0 0.4 57 43 6 3 3.5 0.4 54 46 6 4 5.0 0.4 41 59 6 5 7.0 0.4 41 59 6 6 8.7 0.4 34 66 6 7 10.7 0.4 2 98 1 8 11.3 0.4 65 35 1 。