[发明专利]细胞内荧光响应标记DNA的光点击探针及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种细胞内荧光响应标记DNA的光点击探针及其制备方法与应用。所述的具有荧光响应的DNA光点击探针，为香豆素四唑化合物W1和W2中的至少一种；所述的W1和W2的结构式如式I和式II所示；本发明中的探针具有细胞核靶向性，反应基团体积小不干扰核酸代谢过程，并且本反应过程中具有有荧光响应，光诱导实时可控、反应速度快，特异性强、副产物少、反应条件简单温和及操作简单等优点；所述的具有荧光响应的DNA光点击探针可以应用于活细胞核酸标记领域。

技术领域

本发明属于核酸标记领域，特别涉及一种细胞内荧光响应标记DNA的光点击探针及其制备方法与应用。

背景技术

在生命科学研究领域，具有荧光响应的核酸标记技术在研究核酸分子结构以及其在细胞内的合成过程具有非常重要的价值和意义。尤其是利用生物正交反应触发的荧光响应标记方法经成为一种生物分子标记的重要工具，这种标记方法可以在温和的条件下选择性标记和追踪生物分子，并进行灵敏的可视化荧光成像。最初的标记方法有荧光响应的合成后标记，模板介导的连接和DNA或RNA的代谢标记，这些方法是基于一价铜离子催化的叠氮和炔烃的环化加成反应[Gierlich,J.；Burley,G.A.；Gramlich,P.M.；Hammond,D.M.；Carell,T.Org.Lett.2006,8,3639–3642]。为了打破铜离子催化的高毒性[Kennedy,D.C.；McKay,C.S.；Legault,M.C.B.；Danielson,D.C.；Blake,J.A.；Pegoraro,A.F.；Stolow,A.；Mester,Z.；Pezacki,J.P.J.Am.Chem.Soc.2011,133,17993-18001]荧光响应标记核酸进一步发展为基于非铜催化的生物正交反应，非铜催化的生物正交反应包括张力促进的1，3-两极环化加成反应，狄尔斯-阿尔德反应和亲核加成反应[Domnick,C.；Eggert,F.；Kath-Schorr,S.Chem.Commun.2015,51,8253–8256]。但是即便如此，由于非铜催化的反应基团的尺寸的限制，到目前为止还没有报道过在细胞内有荧光响应的DNA快速标记和成像的方法。在细胞环境内荧光响应标记核酸对于探究核酸的复制及转运过程是非常重要的。

光诱导的叠氮-炔烃环化加成反应即光点击反应是一种非金属催化的具有荧光响应的生物正交反应。光点击反应已经作为一种有效的蛋白定点修饰方法，近年来这种反应引起了很多人的关注。光点击反应已经成功地被证明可以用可见光405nm[An,P.；Yu,Z.；Lin,Q.Chem.Commun.2013,49,9920-9922.]和近红外光700nm激发[Yu,Z.；Ohulchanskyy,T.Y.；An,P.；Prasad,P.N.；Lin,Q.J.Am.Chem.Soc.2013,135,16766–16769]。通过改变四唑化合物的结构来减少紫外光的限制。鉴于这一优势，近期光点击化学反应已经开始被应用于在体外对核酸的修饰[(a)Holstein,J.M.；Stummer,D.；Rentmeister,A.Chem.Sci.2015,6,1362–1369.(b)Arndt,S.；Wagenknecht,H.-A.Angew.Chem.Int.Ed.2014,53,14580–14582]。但是，有的文献报道的四唑化合物通过光点击反应标记核酸后的产物荧光较弱或者无光，有的文献则用四唑化合物可以荧光响应标记RNA[Li,J.；Huang,L.；Xiao,X.；Chen,Y.；Wang,X.；Zhou,Z.；Zhang,Y.J.Am.Chem.Soc.2016,138,15943-15949]。在光点击反应标记核酸的过程中，这种不明确的荧光响应行为成为其首要问题。因此，解决光点击反应标记核酸中的荧光响应问题及探究可以用于活体内代谢标记核酸的具有荧光响应能力的探针具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种细胞内荧光响应标记DNA的光点击探针。该探针具有光点击反应的特征性优点如：反应速度快，反应基团分子为小且易修饰具有烯烃基团的化合物，并且该探针具有细胞核靶向性，适合应用于活细胞内核酸的快速代谢标记。