[发明专利]一种具有生物活性的COX52‑69多肽的固相合成方法及其用途

说明书

技术领域

本发明提供了一种采用化学合成的方法-Fmoc法合成COX_52-69多肽的工艺，采用该方法所合成的COX_52-69多肽在动物体内体外实验，证明其具有生物活性；并且本发明中还提供了所述COX_52-69多肽的用途，属于生物医药技术领域。

背景技术

短肽COX_52-69是一条含有18个氨基酸的多肽，最初是从猪的小肠中分离纯化出来的，经氨基酸序列比对后发现其与细胞色素氧化酶Ⅷ的第52至69完全重叠，所以命名COX_52-69。其序列为LLPAGWVLSHLDSYKKRE。用生化分离纯化得到的COX_52-69多肽做功能实验发现该多肽能够抑制葡萄糖引起的胰岛素的分泌，该发现目前已于2013年10月11日申请中国发明专利，申请号为201310471571.9。在该专利申请中通过从生物组织(猪肠道)中分离纯化获得COX_52-69多肽，但是从生物组织中分离纯化获得COX_52-69多肽是一个高成本的过程。为此需要寻求一种非生化分离的方法以获取有活性的该肽，并能够提高了产量和降低了成本。然而在本领域中，虽然通过化学合成或生物工程的方法获得一个多肽是件容易的事，但是这些获得的多肽通常是没有生物活性的。

发明内容

本发明解决了现有技术中的不足，提供了一种具有生物活性的COX_52-69多肽的固相合成方法，并且利用化学合成的COX_52-69多肽在动物体内体外实验，均发现化学合成的COX_52-69多肽有抑制葡萄糖引起的胰岛素分泌的功能和减轻体重的作用，即具有生物活性。

实现本发明上述目的所采用的技术方案为：

一种具有生物活性的COX_52-69多肽的固相合成方法，该多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：LLPAGWVLSH LDSYKKRE，所述固相合成方法包括以下步骤：

(1)、缩合反应：使用DMF预溶胀树脂，滤去溶剂备用；向反应柱中加入脱保护试剂，反应后脱去树脂上的的FMoc保护基团，抽干，继续采用DMF清洗后抽干，并检测；

称取第一个Fmoc-氨基酸Fmoc-GLu(tBu)-OH，同时称取HOBt备用，将二者同时加入反应柱中，并且溶于DCM中，然后加入DIC并搅拌；称取DMAP投入反应柱中；氨基酸与反应试剂一同反应，反应完毕后抽干并用DMF清洗；向反应柱中加入脱保护试剂，反应后，脱去树脂上的的FMoc保护基团，抽干，继续采用DMF清洗后抽干，并检测；

接下来的按照COX_52-69多肽的顺序重复添加肽链上的下一氨基酸，直至整条肽链18个氨基酸全部添加完成并检测通过；全部完成后，使用无水甲醇清洗并使用抽滤瓶将其抽干；

(2)、肽链的切割：在抽干的合成肽树脂中加入切割液，在通风橱中室温搅拌裂解，使用砂芯漏斗过滤除去树脂，收集滤液，滤液经乙醚萃取后放置于干燥瓶内进行干燥，直至其成为白色粉末，即制得多肽粗品；

(3)、粗肽的检测和纯化：利用高效液相色谱检测合成的多肽粗品，并分析合成产物中多肽的纯度；

(4)、肽的质谱鉴定：用质谱检测多肽粗品的分子量，确定合成的多肽是否是目标产物，最后将收集的样品用三氟乙酸和水溶解制成溶液倒入样品杯中，冷冻过夜，次日用真空干燥剂冷冻干燥，最后获得的白色粉末状物质即为纯品COX_52-69多肽。

步骤(1)中所述脱保护及缩合反应的检测方法如下：检测时分别取三滴5％茚三酮无水乙醇溶液和三滴80％苯酚无水乙醇溶液与待检测树脂颗粒充分混匀，105℃加热5min，观察颜色变化，若变蓝色或紫色，则说明游离氨基存在，脱保护完全；若为亮黄色或无色则表示缩合完全，能够继续进行下一个缩合反应。

步骤(1)中在合成每一个氨基酸时，反应过程中维持温度在25℃～28℃。

步骤(2)中萃取的步骤为：在滤液中按1：10的体积比加入事先4℃下预冷的乙醚，进行萃取，再以每分钟3000转的速度离心2分钟，并使用乙醚清洗离心管，清洗3次，每次清洗都配合有2分钟离心。