[发明专利]一种调控玻璃化冷冻牛卵母细胞中钙离子浓度的方法

说明书

本发明提供一种调控玻璃化冷冻牛卵母细胞中钙离子浓度的方法，其是将体外成熟22h的牛卵母细胞置于含BAPTA‑AM的体外成熟液中孵育2h，然后采用OPS技术，用含10μM BAPTA‑AM和1μM RR的玻璃化冷冻液进行冷冻，解冻后在含RR的体外成熟液中恢复30min，可使玻璃化冷冻牛卵母细胞的卵裂率、囊胚率、囊胚细胞数，以及体外受精能力、发育能力得到显著性提高。本方法具有操作简单，成本低，对卵母细胞无毒无害，能有效保护冷冻卵母细胞的线粒体功能及其发育能力，这对于拓展冷冻卵母细胞的应用范围，具有重要的理论和实际意义，将在牛卵母细胞超低温冷冻研究领域发挥巨大作用。

技术领域

本发明涉及牛卵母细胞超低温冷冻技术领域，具体地说，涉及一种调控玻璃化冷冻牛卵母细胞中钙离子浓度的方法。

背景技术

哺乳动物卵母细胞的冷冻保存是保护物种资源多样性和拯救濒危动物的有效手段，也可以为体外受精、单精子注射和体细胞核移植等胚胎生物技术提供丰富的实验材料，使卵母细胞的供给和使用不受时间和空间的限制。因此，卵母细胞的冷冻保存具有非常重要的理论意义和实用价值，一直是低温生物学领域的研究热点和焦点。目前，由于玻璃化冷冻具有降温速度快、冷冻损伤低、操作简单等优点，已经成为卵母细胞冷冻保存的有效手段(Larman and Gardner,2014)。

尽管哺乳动物卵母细胞的玻璃化冷冻保存取得很大进展(Vajta et al.,1998；Dinnyés et al.,2000；Hou et al.,2005；Zhao et al.,2011)，但其仍远远满足不了畜牧业生产和胚胎生物技术快速发展的需要。究其原因，主要是由于玻璃化冷冻能引起卵母细胞中Ca²⁺浓度异常升高，进而导致皮质颗粒的提前释放，透明带硬化，受精率降低(Larmanet a1.,2006,2007；Tian et al.,2007；Bogliolo et al.,2012；Nikiforaki et al.,2014)，严重影响了玻璃化冷冻卵母细胞应用范围。目前，玻璃化冷冻引起卵母细胞中Ca²⁺浓度升高的机制还不十分清楚，更缺乏能够有效调控玻璃化冷冻卵母细胞中Ca²⁺浓度，提高玻璃化冷冻牛卵母细胞受精能力的有效措施。

发明内容

本发明的目的是提供一种有效调控玻璃化冷冻牛卵母细胞中钙离子浓度的方法，进而提高玻璃化冷冻牛卵母细胞的体外受精及发育能力。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一种用于牛卵母细胞冷冻保存的玻璃化冷冻液，所述冷冻液中含有5-20μM BAPTA-AM(钙螯合剂)和0.5-2μM RR(线粒体钙单向转运体抑制剂，钌红)，用EDFSF40液配制。其中，所述EDFSF40液由EG(乙二醇)、DMSO(二甲基亚砜)和FSF液按照体积比2﹕2﹕6组成。FSF液为含有30w/v％聚蔗糖70(Ficoll 70)、0.5M蔗糖和20％FBS(胎牛血清)的DPBS溶液，不含钙镁。

优选地，本发明的玻璃化冷冻液中BAPTA-AM的浓度为5μM、10μM、20μM，RR的浓度为0.5μM、1μM、2μM。更优选地，BAPTA-AM的浓度为10μM，RR的浓度为1μM。

本发明还提供一种用于牛卵母细胞冷冻保存的试剂组合，包括体外成熟液、含BAPTA-AM的体外成熟液、预处理液、玻璃化冷冻液、解冻液以及含RR的体外成熟液。

所述体外成熟液为含有10μg/mL FSH(卵泡刺激素)、10μg/mL LH(黄体生成素)、1μg/mL雌二醇和10％FBS的M199培养液。

所述含BAPTA-AM的体外成熟液为含有5-20μM BAPTA-AM的体外成熟液。优选地，BAPTA-AM的浓度为5μM、10μM、20μM。更优选地，BAPTA-AM的浓度为10μM。

所述预处理液为含有10％EG和10％DMSO的DPBS溶液(不含钙镁)。