[发明专利]一种调控玻璃化冷冻牛卵母细胞中钙离子浓度的方法

权利要求书

1.一种调控玻璃化冷冻牛卵母细胞中钙离子浓度的方法，其特征在于，将体外成熟22h的牛卵母细胞置于含BAPTA-AM的体外成熟液中孵育2h，然后采用OPS法进行冷冻，采用含10μM BAPTA-AM和1μM RR的玻璃化冷冻液进行冷冻，解冻后在含RR的体外成熟液中恢复30min；

所述含BAPTA-AM的体外成熟液为含有5-20μM BAPTA-AM的体外成熟液；

所述含RR的体外成熟液为含有0.5-2μM RR的体外成熟液；

所述体外成熟液为含有10µg/mL FSH、10µg/mL LH、1µg/mL雌二醇和10％ FBS的M199培养液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）将卵丘-卵母细胞复合体置于体外成熟液中培养22h，然后用透明质酸酶脱去卵丘细胞，收集MII期卵母细胞，转入含BAPTA-AM的体外成熟液中孵育2h；

2）将卵母细胞在预处理液中孵育30s，再转入玻璃化冷冻液中处理25s，然后装入OPS管中直接投入液氮中冻存；

3）解冻时，将OPS管从液氮中取出，将装有卵母细胞的部分迅速置于38.5℃含0.25M蔗糖的DPBS溶液中，用吸管将卵母细胞从OPS管吹出放于38.5℃含0.25M蔗糖的DPBS溶液中1min，然后转入38.5℃含0.15M蔗糖的DPBS溶液中5min，进行解冻；

4）解冻后，将卵母细胞在含RR的体外成熟液中恢复30 min；

所述预处理液为含有10% EG和10% DMSO的DPBS溶液，不含钙镁；

所述玻璃化冷冻液中含有10μM BAPTA-AM和1μM RR，用EDFSF40液配制；

其中，所述EDFSF40液由EG、DMSO和FSF液按照体积比2﹕2﹕6组成；FSF液为含有30w/v%聚蔗糖70、0.5M蔗糖和20% FBS的DPBS溶液，不含钙镁。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、从屠宰场收集牛卵巢，保存于含75µg/mL青霉素和50µg/mL链霉素的35℃生理盐水中2h内送回实验室，从直径为2-8mm的卵泡中抽出卵丘-卵母细胞复合体，挑选至少有3层致密卵丘细胞的复合体清洗后用于体外成熟，50个卵丘-卵母细胞复合体为一组置于盛有500µL体外成熟液，且表面覆盖有矿物油的4孔板中，于38.5℃、5％CO₂的培养箱中培养22h，然后用透明质酸酶脱去卵丘细胞，收集MII期卵母细胞，转入含BAPTA-AM的体外成熟液中在38.5℃、5％CO₂的培养箱中孵育2h；

S2、将卵母细胞在预处理液中孵育30s，再转入玻璃化冷冻液中处理25s，然后装入OPS管中直接投入液氮中冻存；

S3、解冻时，将OPS管从液氮中取出，将装有卵母细胞的部分迅速置于38.5℃含0.25M蔗糖的DPBS溶液中，用吸管将卵母细胞从OPS管吹出放于38.5℃含0.25M蔗糖的DPBS溶液中1min，然后转入38.5℃含0.15M蔗糖的DPBS溶液中5min，进行解冻；

S4、解冻后，将卵母细胞在含RR的体外成熟液中恢复30 min。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述OPS管为两端开口式塑料管，管壁厚0.02mm，体积0.25mL；所述OPS管的一端被人工拉细，用来盛放卵母细胞，拉细一端OPS管的顶端外直径为0.23mm。