[发明专利]一种提高蛋白浓度测定准确性的快速测定试剂及其测定方法

说明书

本发明提供了一种提高蛋白浓度测定准确性的快速测定试剂及其测定方法，所述测定试剂包括沉淀试剂，碱性铜试剂和生色试剂。所述沉淀试剂能够将蛋白样品溶液中的蛋白沉淀出来，且蛋白没有损失；所述碱性铜试剂溶解沉淀的蛋白并与蛋白的肽键结合；所述生色试剂，在未与蛋白结合的碱性铜试剂被还原后与所述生色试剂反应，产生特定范围的吸收波长，最佳吸收波长的吸收值与蛋白样品溶液中的蛋白量有良好的线性关系，可以用于常规生物技术蛋白实验特别是用于生物医药中蛋白药物浓度的精确测定，应用前景广阔。

技术领域

本发明属于生物技术的应用领域，涉及到一种提高蛋白浓度测定准确性的快速测定试剂及其测定方法，特别但不限于应用于生物制药中蛋白药物样品浓度的精确定量。

背景技术

蛋白浓度测定是蛋白生物技术(包括生物制药中蛋白药物)实验中一项基本实验内容，它是进行SDS-PAGE电泳、Western Blot、Elisa、蛋白酶活性测定、蛋白二维电泳、蛋白质谱、蛋白分子量测定、蛋白测序等实验的基本前提，比较常见的为蛋白浓度测定方法包括Bradford法，Lowry法，BCA法等。

根据汪家政的蛋白质技术手册一书所述，Bradford试剂在酸性条件下，与蛋白的结合能力与蛋白中所含赖氨酸、精氨酸和组氨酸所带电荷相关，同时范德华力和疏水作用力也参与了蛋白与染料的结合。由于各种蛋白所含有赖氨酸、精氨酸和组氨酸的数量变化比较大，导致不同样品的变异系数明显偏大，同时Bradford试剂与蛋白混合后，必须在10分钟内完成吸收值得测量，否则随着时间的延长，染料复合体以及蛋白-染料复合体会逐渐沉降，导致吸收值明显降低，这样在做大量蛋白样品定量时，它所具有的缺点就更加明显，同时也容易受到蛋白样品溶液中存在的各种离子或非离子或两性去污试剂的干扰。Lowry法是蛋白在碱性溶液中肽键与Cu²⁺螯合，形成蛋白-铜复合物，在还原剂磷钼酸-磷钨酸试剂的作用下，产生蓝色的化合物，蓝色深浅与蛋白浓度呈线性关系，该方法适用于脂类含量较高的样品的测定，也能够耐受较高浓度的去污试剂，但易受硫酸铵、Tris、甘氨酸和各种硫醇的影响，而且颜色深浅随不同蛋白而产生变化，标准曲线不是严格的直线形式，且专一性较差。BCA法基于双缩脲原理，碱性条件下蛋白将Cu²⁺还原为一价铜，BCA与一价铜螯合，产生蓝紫色复合物并在562nm有吸收峰。吸收值与蛋白浓度的线性关系较好。该方法主要是蛋白中的肽键参与了反应，同时也与蛋白中的半胱氨酸、胱氨酸、酪氨酸、色氨酸含量有关，由于不同蛋白中氨基酸的组成不同，Bradford法吸收值的变异系数在不同蛋白样品中明显大于BCA法，同时在常规的蛋白提取、纯化、保存的过程中，通常是需要加入低浓度的还原试剂(DTT，巯基乙醇等)，以保持蛋白的稳定，避免蛋白的变性和沉淀，但是还原试剂存在会导致BCA法中的二价铜被还原，吸收值明显增加，从而测定的蛋白样品浓度明显偏高。

以上的三种用于蛋白浓度测定方法，要么受蛋白氨基酸组成成分的影响，不同蛋白的变异系数较大，而且颜色的稳定性也较差；要么受各种干扰试剂的影响，蛋白浓度与吸收值得线性关系不好；要么受蛋白溶液中所添加还原试剂的影响，蛋白浓度测定的结果产生偏差。

发明内容

发明目的：为了克服以上不足，本发明的目的在于提供一种蛋白样品精确定量的快速测定试剂及其测定方法，以克服现有技术在蛋白样品定量过程中，由于不同样品蛋白氨基酸组成差异，蛋白样品中存在的各种干扰试剂，蛋白与试剂形成的有色复合物稳定性差所造成的对蛋白样品定量所产生的偏差。

技术方案：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供了一种提高蛋白浓度测定准确性的快速测定试剂，包括

沉淀试剂，所述沉淀试剂能够将蛋白样品溶液中的蛋白沉淀出来，且蛋白没有损失，并可进一步去除位于上清中的各种化学试剂；

碱性铜试剂，所述碱性铜试剂溶解沉淀的蛋白并与蛋白的肽键结合；