[发明专利]一种提取木本植物花粉管核蛋白的方法及其试剂盒

说明书

本发明提供一种提取木本植物花粉管核蛋白的方法及其试剂盒。所述试剂盒中包括试剂A、试剂B和试剂C；所述试剂A中含有纤维素酶和离析酶，所述试剂B中含有Hepes、NaCl、MgCl₂、NaF、PMSF和DTT，所述试剂C中含有丙三醇、TritonX‑100、DTT和PMSF。本发明以苹果花粉管为试材，通过收集、酶解花粉管壁后，进行核蛋白提取。采用本发明的方法可以提取大量、相对纯净的花粉管核蛋白，为直观鉴定木本植物花粉管内核蛋白的表达及定量提供技术体系。

技术领域

本发明涉及植物生物技术领域，具体地说，涉及一种提取木本植物花粉管核蛋白的方法及其试剂盒。

背景技术

细胞核蛋白是亚细胞蛋白质的一部分，提取获得纯净的细胞核蛋白对于研究蛋白的性质、表达及信号转导过程都具有重要的意义。核蛋白的提取是研究功能基因的转录调控及信号转导的基础。目前对于植物核蛋白的提取已有报道，但适用于木本植物花粉管核蛋白提取的方法较少。由于花粉管存在材料收集及研磨效率低的问题，同时木本植物的细胞壁组成成分也较为复杂，因此对于花粉管中的转录因子的研究更为困难。

发明内容

本发明的目的是提供一套用于提取木本植物花粉管核蛋白的试剂组合及其试剂盒。

本发明的另一目的是提供一种提取木本植物花粉管核蛋白的方法。

为了实现本发明目的，本发明提供一套用于提取木本植物花粉管核蛋白的试剂组合，包括试剂A、试剂B和试剂C；所述试剂A中含有纤维素酶和离析酶，所述试剂B中含有Hepes、NaCl、MgCl₂、NaF、PMSF(苯甲基磺酰氟)和DTT(二硫苏糖醇)，所述试剂C中含有丙三醇、TritonX-100、DTT和PMSF。

其中，所述试剂A中纤维素酶和离析酶的质量百分含量分别为0.4-0.6％(优选0.5％)和1％，pH值为6.5-7.0(优选pH6.8)，以水配制。所述纤维素酶和离析酶优选为纤维素酶R10和离析酶R10。

所述试剂B中Hepes、NaCl、MgCl₂、NaF、PMSF和DTT的浓度分别为20-30mM、80-120mM、10-20mM、10-20mM、1-3mM和10-20mM，以水配制。优选地，试剂B中Hepes、NaCl、MgCl₂、NaF、PMSF和DTT的浓度分别为25mM、100mM、15mM、10mM、1mM和10mM。

所述试剂C中丙三醇和TritonX-100的质量百分含量分别为15-25％和1-2％，DTT和PMSF的浓度分别为2-5mM和0.5-1.5mM，以水配制。优选地，试剂C中丙三醇和TritonX-100的质量百分含量分别为20％和1.5％，DTT和PMSF的浓度分别为3mM和1mM。

本发明还提供一种用于提取木本植物花粉管核蛋白的试剂盒，所述试剂盒包含上述试剂组合。

本发明进一步提供一种利用上述试剂盒提取木本植物花粉管核蛋白的方法，包括以下步骤：

1)花粉管体外萌发，用试剂A酶解花粉管，得到酶解产物；

2)用尼龙网过滤所述酶解产物，弃滤液，收集花粉管原生质体；

3)用试剂B裂解花粉管原生质体，获得花粉管原生质体粗蛋白；

4)滤纸过滤粗蛋白，离心收集细胞核；

5)用试剂C裂解细胞核，离心收集的上清液中含有木本植物花粉管核蛋白。

前述的方法，步骤1)中待花粉管体外萌发至长度15-20μm，进行酶解。酶解条件为：37℃避光酶解2-4h。试剂A的用量为500-1000μl/200mg花粉管(优选约800μl/200mg花粉管)。