[发明专利]一种胶原/硫酸软骨素复合人工眼角膜及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种胶原蛋白/硫酸软骨素复合人工角膜的制备方法，属于生物材料领域。

背景技术

在全球范围内，角膜病患者数量高达三亿，且这一数据正处在逐年递增。同时，由于角膜供体严重短缺，以及存在安全性不可控等其他问题，导致角膜病治疗困难。利用组织工程技术体外制备人工角膜的新思路为广大科研工作者所关注。

目前人工角膜的研究主要集中在光学镜柱材料和支架材料方面。光学镜柱材料要求其具有良好透光性，一般多采用聚甲基丙烯酸甲酯(polymethy1methacrylate，PMMA)，但存在硬度高，不宜高压加热蒸汽消毒，表面细胞粘附性差等问题。而基于生物材料制备的孔隙支架材料则有利于减轻免疫排斥反应，有较好的发展前景。由此，寻找一种组织相容性好、性能优异的人工角膜支架材料成为亟待解决的问题。

胶原蛋白(Collagen，Col)，作为细胞外基质中一种重要的结构蛋白，在哺乳动物内含量丰富，约占到其自身蛋白质总量的25-33％。胶原蛋白具有三股肽链螺旋的特殊结构，拥有热变性，是优良的组织工程支架的生物材料。约占角膜厚度90％的基质层则由有序排列的胶原纤维板及铺展其间隙的分支状角膜基质细胞构成。可见胶原蛋白是角膜细胞外基质中的主要成分。它是由三股肽链通过强氢键、静电作用力形成三螺旋构象，呈现刚性链，能自组装形成纤维。胶原支架材料具有很多优点，它能为表皮细胞的迁移、增殖铺垫了支架，并提供了良好的营养基础，有利于上皮细胞的增生修复，因而能促进创面的愈合。然而，由于胶原分子中存在强的非共价键力而具有较高的结晶度，使得它无法溶解于普通溶剂中。目前，制备的胶原膜因力学性能差、降解快等缺点而无法真正得到应用。

硫酸软骨素是一类糖胺聚糖(GAGs)，广泛分布于动物组织的细胞外基质和细胞表面。硫酸软骨素对角膜胶原纤维具有保护作用，能促进基质中纤维的增长，增强通透性，改善血液循环，加速新陈代谢，促进渗透液的吸收及炎症的消除；其聚阴离子具有强的保水性，能改善眼角膜组织的水分代谢，对角膜有较强的亲和力，能在角膜表面形成一层透气保水膜，改善眼部干燥症状。通过促进基质的生成，为细胞的迁移提供构架，有利于角膜上皮细胞的迁移，从而促进角膜创伤的愈合，渗出液的吸收及炎症的消除。然而，有关以胶原和硫酸软骨素进行化学交联制备组织工程材料的研究鲜有报道。

因此，寻找一种性能优良，接近天然眼角膜特性的人工角膜支架材料显得尤为重要，材料需具备的性能有：

1、生物相容性高，可降解，免疫排斥反应少；

2、力学性能优良，具有投入临床应用的可行性；

3、采用无毒副作用的交联剂交联，方法简便易操作；

4、角膜上皮细胞能够在人工角膜构筑的三维网络中良好地生长、增殖和再生。

目前国内外文献中对人工角膜的研究大多集中在主要原料为合成高分子上，对本发明涉及的利用角膜组织主要成分的胶原蛋白和硫酸软骨素为原料还未有报道。

发明内容

本发明公开了一种胶原/硫酸软骨素复合人工眼角膜的制备方法。利用本发明所述的方法制备人工角膜具有优良力学性能和透光性，且生物相容性好等优点。

为实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

将胶原冻干原料溶于一定浓度的咪唑类离子液体溶液中制备得到不同浓度的胶原蛋白-离子液体混合体系。溶解充分的胶原浓溶液进行离心脱气泡，再采用流延法将其倾倒于模具中铺展成膜，模具浸泡在95％乙醇凝固浴中4-5h进行再生成型，然后用80％乙醇水溶液进行多次浸泡洗涤以置换出凝胶膜中的离子液体，最终得到厚度约为0.2mm凝胶薄片，在18℃恒温箱中脱水干燥形成胶原膜。将以上胶原凝胶浸泡在MES缓冲溶液中2h达到平衡，同时配置不同浓度的硫酸软骨素溶液，完全溶解后，用交联剂EDC-NHS对硫酸软骨素进行活化05h。将上述MES平衡的胶原凝胶浸泡在活化好的硫酸软骨素溶液中，进行交联反应4h。然后将凝胶膜取出，用超纯水洗涤三次，室温下晾干，即得不同交联度的胶原/硫酸软骨素(Col/CS)复合膜。将交联膜浸泡于1-100μg/mL生长因子FGF-10溶液中1-3小时，得到湿态胶原/硫酸软骨素/FGF-10复合膜Col/CS/FGF。