[发明专利]利用磁性纳米粒子底物固定化催化合成糖苷化合物的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及利用磁性纳米粒子底物固定化催化合成糖苷化合物的方法。

背景技术

在生物催化反应中，酚类物质作为反应底物会影响菌体的活性，造成催化剂的活性下降甚至使催化剂丧失催化作用。消除底物对菌体的毒害作用成为生物催化工业的一个瓶颈，严重阻碍了生物催化工业的发展，抑制了目标产物产量的提高。

固定化技术是利用化学或物理手段将物体定位于限定空间区域的一门新兴技术，经过固定化的底物可以慢慢从载体中释放出来，使反应体系中的底物浓度处于菌体耐受度以内，不会影响酶的活性和微生物的新陈代谢，从而较好地催化合成产物，有效提高产物产量。

磁性纳米粒子因具有尺寸小、超顺磁性和低毒性等特点，已经引起了生物化工行业的广泛关注。但是磁性纳米粒子之间强烈的磁性偶极-偶极之间的吸引力导致磁性粒子容易发生聚集。因此，常用一些表面活性剂、氧化物、金属纳米粒子或带有一些特殊官能团的聚合物来修饰磁性纳米粒子，在提高磁性纳米粒子稳定性的同时还能使其吸附一些特定物质，大大拓宽了磁性纳米粒子在生物领域的应用。

Xiaoli Zhao等采用二氧化硅/四氧化三铁磁性纳米粒子对环境水中的酚类物质进行富集并分析成分（Zhao X. Preparation of silica-magnetite nanoparticle mixed hemimicelle sorbents for extraction of several typical phenolic compounds from environmental water samples.[J]. Journal of Chromatography A, 2008, 1188(2):140-147.）。李晓飞等用壳聚糖/ ZnFe2O4磁性纳米粒子吸附并处理了苯酚工业废水（李晓飞, 黄绍洁. 壳聚糖包缚草酸铁处理含酚废水研究[J]. 环境科技, 2007, 20(3):26-28.）。以上文献中均探究了磁性纳米粒子对酚类物质的吸附和富集，但是对于吸附后的利用没有做进一步的研究。中国专利“CN1279163”公布了一种发酵生产糖苷类化合物的方法，该方法直接通过野油菜黄单胞菌发酵生产α-熊果苷。中国专利“CN100478451”中合成糖苷类化合物的方法则是通过游离细胞或固定化细胞催化合成4-羟苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷。以上两个专利中涉及到的方法都不能避免有毒底物对于细胞的毒害作用,从而导致底物添加量受到限制。中国专利“CN103805657”公布了一种通过固定化底物提高产物产量的方法，该方法用大孔吸附树脂固定化有毒底物，用游离细胞在缓冲溶液系统中催化有毒底物与双糖合成糖苷类化合物。该方法虽然能够避免有毒底物对细胞的毒害，但是底物固定化的量难以突破，且后期分离成本高。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，用磁性纳米粒子对有毒底物酚类进行固定化，然后用固定化酚类替代传统的游离底物在最佳反应条件下进行催化反应生产目的产物，在目前的研究基础上将产物产量提高三至五倍。该方法可增强反应体系对有害底物的耐受度，提高底物添加量，简化产物后续分离纯化工艺及减少有毒废水排放，降低了目的产物生产成本，为大规模低成本生产目的产物奠定了基础。

本发明的整体技术构思是：利用磁性纳米粒子固定化酚类底物，然后用固定化底物替代传统的游离底物与糖类进行催化反应，该方法由下列工艺步骤组成：

（1） 固定化底物的制备，其中包括固定化载体的制备和底物酚类的固定化；

（2）野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris ）CGMCC NO.1243菌体的培养，其中包括种子培养和发酵罐培养；

（3）加入固定化底物进行催化反应；

（4）产物的分离纯化；

（5）固定化载体的重复使用。

本发明的具体工艺步骤及工艺条件是：

步骤（1）中固定化底物的制备：

先制得质量百分比浓度为1-10％的酚类水溶液；向100 ml酚类水溶液加入5-15g磁性纳米粒子进行吸附；吸附结束后磁性分离，去离子水多次清洗以除去残留的酚类物质。制得吸附量为0.05-3 g酚类物质/g磁性纳米粒子的固定化底物。

步骤（2）中种子液和发酵液由下列重量份组分组成：

糖20-60份、蛋白胨1-20份、酵母粉1-5份、硫酸镁0.5-1份、磷酸氢二钾1-5份、氯化钠1-5份和水1000份；