[发明专利]一种口蹄疫病毒嵌合病毒样颗粒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及病毒疫苗生产技术领域，具体涉及一种口蹄疫病毒嵌合病毒样颗粒及其制备方法。

背景技术

病毒样颗粒（Virus-like Particles，VLPs）是一种含有某种病毒一种或多种结构蛋白的空心颗粒或包膜状颗粒结构。VLPs不含病毒核酸，且不能自主复制，不存在基因重组或重配和毒力回复的可能，作为疫苗使用时具有较高的安全性。同时，VLPs在形态结构上与天然病毒颗粒相同或相似，可通过和天然病毒感染相同的途径呈递给免疫细胞，有效地诱导机体的免疫系统产生免疫保护反应。目前，国内外相关研究已利用昆虫杆状病毒表达系统在体外成功表达并制备了O型口蹄疫病毒的VLPs，但研究同时显示，相比于其它血清型的口蹄疫病毒，O型口蹄疫病毒VLPs的耐酸性较低，在pH值较低的昆虫细胞中表达时其表达量会受到影响，而且表达后VLPs的组装效率较差。

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种口蹄疫病毒嵌合病毒样颗粒及其制备方法。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：一种口蹄疫病毒嵌合病毒样颗粒，所述嵌合病毒样颗粒为口蹄疫病毒嵌合蛋白，所述嵌合蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。

本发明的第二个目的是提供了上述一种口蹄疫病毒嵌合病毒样颗粒的制备方法，包括以下步骤：

1）合成嵌合衣壳蛋白P12A基因：

以A型口蹄疫病毒F72株的衣壳蛋白基因P12A为骨架载体，将其结构蛋白VP1基因替换为O型口蹄疫病毒BY/CHA/2010株的VP1基因，从而形成O-A嵌合的口蹄疫病毒衣壳蛋白序列P12A(O-VP1)，其DNA序列如序列表中SEQ ID NO.2所示；

2）合成3C基因：

3C蛋白酶的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.3所示，其DNA序列如序列表中SEQ ID NO.4所示；

3）重组转移载体pFastBac Dual-P12A3C(O-VP1)的构建：

将步骤1）得到的O-A嵌合的口蹄疫病毒衣壳蛋白P12A(O-VP1)与杆状病毒表达载体pFastBac Dual同时用限制性内切酶EcoRI and HindIII双酶切，回收后的P12A(O-VP1) 片段和pFastBac Dual片段连接后转化TOP10感受态细胞，挑取单克隆菌落后摇菌提取质粒，将双酶切及测序鉴定为阳性的重组质粒命名为pFastBac Dual-P12A(O-VP1)；然后将重组质粒pFastBac Dual-P12A(O-VP1) 和步骤2）得到的3C 基因片段分别用限制性内切酶NcoI和 KpnI双酶切，回收酶切产物并连接，最后将鉴定正确的重组转移载体命名为pFastBac Dual-P12A3C(O-VP1)；

4）重组杆状病毒rBacmid-P12A3C(O-VP1)的构建：

将步骤3）得到的重组转移载体pFastBac Dual-P12A3C(O-VP1)转化DH10Bac™ Escherichia coli感受态细胞后进行蓝白斑筛选，挑选阳性克隆并提取重组杆状病毒质粒rBacmid-P12A3C(O-VP1)，利用通用引物M13F/R 进行PCR鉴定；

5）重组杆状病毒rBac-P12A3C(O-VP1)的构建：

步骤4）得到的重组杆状病毒质粒rBacmid-P12A3C(O-VP1)在Cellfectin® II Reagent转染试剂的协助下转染Sf9 细胞，置于27℃细胞培养箱中培养72小时，Sf9细胞出现病变后，将细胞吹打下来置于离心管中剧烈振荡，除去细胞和碎片并收集上清液，即得到第一代重组杆状病毒rBac-Dual-P12A3C 和rBac-Dual，将重组杆状病毒在Sf9细胞中传代培养至第三代，保存备用。

本发明的有益效果为：本发明首次以耐酸性较高的A型口蹄疫病毒衣壳蛋白为载体骨架，将O型口蹄疫病毒主要抗原蛋白VP1嵌合至A型口蹄疫病毒衣壳蛋白中，并在昆虫杆状病毒表达系统中成功的表达了该嵌合VLPs，进一步将其做为疫苗免疫豚鼠，使豚鼠获得了较高的抗O型口蹄疫病毒的体液和细胞免疫水平，并在攻毒实验中产生了较高的免疫保护率，为今后口蹄疫新型疫苗的开发提供了新的思路和方法。

附图说明

图1显示为重组杆粒及重组杆状病毒的PCR鉴定结果。