[发明专利]一种DsRED2报告基因在棉花遗传改良中的应用

说明书

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及具体涉及一种DsRED2报告基因在棉花遗传改良中的应用。所述的DsRED2可作为报告基因对转基因材料进行筛选，由于红色荧光蛋白可视性强，可以直接根据肉眼观察筛选转基因材料。显微观察时DsRED2报告基因可以避免棉花组织器官的自发荧光和叶绿素自发荧光干扰。DsRED2报告基因在不同遗传背景下可以稳定表达，DsRED2基因也可以应用于棉花杂交种的识别，以DsRED2转基因棉花株系材料作为父本以其它棉花品种作为母本生产杂交种时，在母本棉花植株上收获的红色种子即为杂交种子，利用本发明可以快速识别杂交种。

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种DsRED2报告基因在棉花遗传改良中的应用，所述的应用包括在棉花遗传转化及杂交种识别方面的应用。

背景技术

NPTII基因是在植物遗传转化中最常用遗传标记基因，该基因使植物产生对卡那霉素的抗性所以可以利用卡那霉素对转化植物进行筛选。随着报告基因的发展应用，报告基因已经广泛应用于植物基因工程方面的研究。报告基因具有是其表达产物易进行定性定量分析，检测方法简单可行、灵敏性好、重复性高；表达产物在细胞内的内源性低；报告基因与目的基因同步表达等优点(薛丽香等2002)。在棉花遗传转化中应用最广泛的报告基因是GUS和GFP。GUS基因的表达产物可以水解底物5-溴-4-氯-3-吲哚-葡萄糖醛酸苷，且水解产物是蓝色的，肉眼可以观察到，因此可以通过组织化学染色进行初步检测。GFP是目前荧光蛋白中应用最为广泛的一种报告基因，可在激发光照射下进行检测不需要添加任何的底物或辅助因子。但是GUS作为报告基因检测时需要添加底物对待检测的组织进行染色，GFP作为报告基因检测时需要外源激发光照射，且在GFP检测的激发波长下棉花组织有很强的自发荧光对检测的准确性产生影响，叶绿素的自发荧光也会遮盖GFP荧光信号。红色荧光蛋白则来源于珊瑚。红色荧光蛋白与绿色荧光蛋白具有同源性。红色荧光蛋白具有检测不需要额外添加底物、可以避免植株本身自发荧光的干扰、可视性强可用肉眼直接观察、对细胞或组织无损伤等优点。DsRED2基因由DsRED改良获得，激发光和发生光为563和582nm。目前红色荧光蛋白多应用在活体动物的光学成像方面，也可用做植物遗传转化的报告基因，已经在烟草、拟南芥、水稻、大豆、玉米等植物中成功应用。

在生物界杂种优势是普遍存在的一种规律。杂种优势是指两个形状不同的亲本杂交产生的后代在生长势、圣火力、繁殖力、适应性以及产量品质等性状超过双亲的现象。在育种中杂种优势利用是培育高产、优质、多抗性品种的一种重要途径。棉花杂交种在我国棉花生产中占重要地位，在丰产性、抗性、营养生长、生殖生长等方面都具有较好的优点。从棉花单株铃数、铃重、子指等产量构成因素上看棉花杂交种都较高，杂交棉在生殖生长方面有较高优势(曹雯梅等2006)。目前棉花杂种优势利用的途径及方法主要有人工去雄、化学杀雄及雄性不育系的利用等，但是在制种过程中混杂现象时有发生，质量监督任务繁重。所以寻找一种快速、经济的杂交种检测技术具有重要意义。2012年刘水利等建立了GFP基因在棉花杂交种纯度检测的方法。但利用GFP进行检测过程仍需要大量制作切片显微观察。随着红色荧光蛋白在棉花中的成功应用申请人寻找到一种可直接观察更加快速、经济的识别杂交种的方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种DsRED2报告基因在棉花遗传改良中的应用。本发明提供了一种检测更为方便、可视性强的报告基因在棉花遗传转化过程和杂交种的识别中的应用。申请人将红色荧光蛋白DsRED2基因通过pCAMBIA2300载体导入到棉花中，确定其可以在棉花各个组织器官中高量表达有明显表型，同时利用显微观察方法避免棉花组织器官的自发荧光和叶绿素自发荧光干扰。由于红色荧光蛋白可视性强可直接根据肉眼观察筛选转基因材料，在实验过程中进行正反交实验确定可以应用到快速识别杂交种。本发明以DsRED2转基因株系材料作为父本以其它棉花品种作为母本制备杂交种时，可在母本植株上收获的红色种子即为杂交种子，利用本发明可快速识别棉花杂交种。

本发明的技术方案如下所述：