[发明专利]一种重组大肠杆菌菌株生产长链二元酸的方法

说明书

技术领域

本发明适用于生物化工领域，具体涉及一种重组大肠杆菌菌株生产长链二元酸的方法。

背景技术

a,ω-长链二元酸是指含有10个以上碳原子的直链二元羧酸。它是一类用途很广的重要精细化工原料，广泛应用于芳香剂、防腐剂和聚合物等。

a,ω-长链二元酸在自然界不存在，目前根据长链二元酸的不同碳原子个数有两种方法进行生产，一种是化学合成法，一种是生物发酵法。化工合成法主要是以石油原料进行生物转化(Liu et al.,2011，Biomacromolecules，12:3291–3298)，但是采用化学法生产有其局限性，首先是化学合成法的条件苛刻、生产工艺复杂，而且产物产率低、危险性大、易污源环境。微生物发酵法则相对来说条件比较温和，而且污染较小。

关于微生物发酵法，目前有报道在利用炼油副产物如十二烷烃或其衍生物作为底物(W.Lu et al.,2010,Chem.Soc.,132,15451./P.Fickers et al.,2005,Biotechnol.Lett.,27,859.)，利用酵母进行发酵生产长链二元酸。但是以炼油副产物十二烷烃或其衍生物作为底物会存在供给限制，而且原料不可持续性，而且酵母生长和发酵周期长，增大了成本，产物多样性比较差，因此寻找或构建一些发酵周期短，生产工艺简单微生物或重组菌株利用可持续性原料进行此类发酵生产具有重要的意义。

目前也有在大肠杆菌中通过表达ω-羟化酶，如食油假单胞来源alk系列单氧酶(Manfred Schrewe et al.,Catal.2011,353,3485–3495)或者细胞色素P450系列单氧酶(Sumire Honda Malca et al.,Commun.,2012,48,5115–5117)等，将添加的底物脂肪烃、脂肪酸酸或者脂肪酸甲酯等转化为相应的ω-羟基化产物，如果产物是ω-羟基脂肪酸则可以在醇还原酶和醛还原酶的作用下进一步转化为a,ω-二元酸。大肠杆菌生长周期比酵母短，但是这种转化方式需要外源添加底物，而且不同链长脂肪烷烃或其衍生物进入细胞困难，虽然也有通过表达外膜蛋白alkL基因(Mattijs K et al.,2012,Applied and Environmental Microbiology,5724–5733)提高脂肪酸甲酯的细胞输入，但是相对来说产率还是比较低。因此如何能让细胞自行进行相应链长脂肪烷烃或其衍生物的合成，进而进一步在胞内通过末端羟化酶进行氧化是本领域技术人员研究的方向。

发明内容

本发明的目的是克服了现有技术的不足，提供一种重组大肠杆菌菌株生产长链二元酸的方法，即在基因工程微生物中利用可持续碳源实现长链二元酸的微生物发酵法生产。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种重组大肠杆菌菌株，所述重组大肠杆菌菌株是通过敲除或弱化了大肠杆菌中的脂肪酸β-氧化降解的路径基因获得的。

本发明提供的另一个目的是提供一种由上述重组大肠杆菌菌株生产长链二元酸的方法，所述的方法是通过所述重组大肠杆菌菌株利用可持续性碳源积累得到长链脂肪酸，并进一步将所述长链脂肪酸转化得到长链二元酸。

具体的，所述方法通过在所述重组大肠杆菌菌株中表达长链脂肪酸的合成基因以及调控基因得到所述的长链脂肪酸。

更为具体的，所述长链脂肪酸的合成基因为具有序列表中SEQ ID NO:1核苷酸序列的加州月桂来源的硫酯酶fatB基因。

更为具体的，所述长链脂肪酸的调控基因为大肠杆菌来源的fadR基因。

具体的，所述方法通过在所述重组大肠杆菌菌株中表达ω-羟化酶、醇还原酶和醛还原酶，从而将积累的所述的长链脂肪酸转化形成所述的长链二元酸。

更为具体的，所述的ω-羟化酶包括alkBFGT系列单氧酶和细胞色素P450羟化酶。

更为具体的，所述的醇还原酶为醇还原酶alkJ。

更为具体的，所述的醛还原酶为醛还原酶alkH。

具体的，所述的碳源为葡萄糖。