[发明专利]一种猪流行性腹泻新型抗体ELISA检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及免疫检测技术领域，具体是涉及一种猪流行性腹泻新型抗体ELISA检测试剂盒.

背景技术

猪流行性腹泻(PED)是严重危害我国养猪业的一个猪病，抗体检测是防控的关键，然而国内外尚无成熟的PED ELISA抗体检测试剂盒。

目前市场上虽然有韩国安捷PED ELISA抗体检测试剂盒，但只能检测初乳中的IgA，并且这些试剂盒在国内均没有注册，因此，目前国内外尚且没有成熟的、商品化的PED ELISA抗体检测试剂盒。

发明内容

本发明解决的技术问题是以杆状病毒表达的PED抗原为基础，研制灵敏度高、特异性和稳定性强的ELISA抗体检测试剂盒，用于猪流行性腹泻病毒抗体的快速检测。

本发明的技术方案是：一种猪流行性腹泻新型抗体ELISA检测试剂盒，所述试剂盒包括包被了猪流行性腹泻抗原的酶标板、阴性对照血清、阳性对照血清、20X浓缩洗液、酶标抗原、底物缓冲液A、底物液B、终止液。

进一步地，在上述方案中，所述包被了猪流行性腹泻抗原的酶标板的制备过程中，所用的包被原是通过杆状病毒表达系统获得的PEDV-S蛋白，所用包被液是碳酸钠缓冲液，所用封闭液是含1％明胶的上述包被液。有前期研究结果表明PEDV的S蛋白可以辨别靶细胞及促使病毒和细胞膜的融合，故被认为在免疫介导中起着重要作用，而有研究表明感染PEDV的猪血清中的抗S蛋白抗体比抗N蛋白抗体更为持久，即可在更长的时间中检测到抗S蛋白的抗体，因此S蛋白是建立PEDV血清学检测方法的首选抗原。

进一步地，在上述方案中，所述酶标抗原是利用辣根过氧化物酶(HRP)通过过碘酸钠法对PEDV-S蛋白进行标记。所述阴、阳性对照血清通过IFA试验鉴定获得。

进一步地，在上述方案中，所述20X浓缩洗涤液配方为：氯化钠8g、磷酸二氢钾0.2g、磷酸氢二钠3g、氯化钾5g、吐温-20 2mL、蒸馏水20mL。

进一步地，在上述方案中，所述底物缓冲液A为过氧化脲溶液，底物缓冲液A配方为每1000mL水中加入过氧化脲1g，10.3g柠檬酸，35.8g Na2HPO4·12H2O，吐温-20 100μL，pH5。

进一步地，在上述方案中，所述底物液B为四甲基联苯胺(TMB)溶液，底物液B的配方为每1000mL蒸馏水中加入四甲基联苯胺(TMB)700mg(40mL DMSO溶解)，10.3g柠檬酸，pH2.4。

进一步地，在上述方案中，所述终止液配方：2M浓硫酸。

一种猪流行性腹泻新型抗体ELISA检测试剂盒，其使用方法为：

S1：待测血清或初乳经前处理后备用；

取出试剂盒，在室温下平衡30分钟备用；

20X的浓缩洗液按所需量稀释成1X备用，阴、阳性对照血清或初乳各做两个重复，加入100μL 1X浓缩洗液稀释的待检血清或初乳，37℃孵育40分钟；

倒出孔中的液体，用稀释好的PBST洗5次，将酶标板倒置在吸水纸上拍干；加入按1:200稀释好的酶标抗原100μL，37℃孵育30分钟；

倒出孔中的液体，用PBST洗板5次，拍干；取底物缓冲液A和底物液B等体积混匀，每孔加100μL，在暗处显色10-15分钟，每孔加入50μl的终止液终止反应，酶标仪上测定各孔在波长为450nm处的OD值；

S2：结果计算，用所建立的双抗原夹心ELISA方法检测30份阴性血清或初乳，血清或初乳1:100稀释，100μL/孔，每份血清或初乳重复2孔，按照以上已确立的ELISA程序进行ELISA测定，读出D450值，计算30份血清或初乳的D450平均值和标准差；

S3：根据统计学原则，D450值平均数+3×标准方差时，可以在99.9％的水准上判定为阳性，因而设定阴阳性临界值等于阴性血清或初乳的D450值平均数+3×标准方差，求得阴阳性临界值0.4，在规定的实验条件下，其D450值大于临界值，即待检血清样本D450﹥0.4，判为阳性，反之为阴性。

进一步地，上述的猪流行性腹泻新型抗体ELISA检测试剂盒的检测原理是：酶标板上的每个孔均包被有相同量的抗原，加入待测血清后，固相包被抗原和待测血清中的抗体反应，形成固相抗原抗体复合物，洗涤除去未结合物质，再加入酶标抗原，固相免疫复合物上的抗体与酶标抗原结合，彻底洗涤未结合的酶标抗原，加入底物缓冲液A和底物液B，显色反应浅，用酶标仪检测的OD值低，表明血清中抗体水平低；反之，当待测血清中抗体含量高时，则所测的OD值高，显色反应深。根据阴、阳性对照血清的值计算待检血清抗体的阴阳性。