[发明专利]普通小麦中维生素B2含量的高效液相色谱测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种普通小麦中维生素B2含量的高效液相色谱测定方法。

背景技术

小麦是世界第二大粮食作物，在全球各地广泛种植。我国是小麦生产和消费量最大的国家，2016年小麦种植面积达到24186.5千公顷，总产量约为1.29亿吨。随着经济和社会的发展，消费者的生活需求正在发生变化，小麦营养品质备受关注。B族维生素是维持人体生命活动必需的一类有机物质，特别是维生素B2与心血管疾病、口角炎、唇炎和皮肤炎等疾病密切相关。由于人类和动物自身不能合成维生素B，必须从外界摄取，而谷类食物既富含维生素B族成分又是人们重要的日常食物来源，因此准确测定小麦面粉中维生素B2的含量对评价小麦营养价值及品质育种具有重要的指导性意义。

现阶段，维生素B2的检测方法包括国际上的微生物法和国标的荧光分光光度计法。其中，微生物法定量结果准确，但前处理步骤繁琐，培养时间长，技术难度大，重复性差；荧光分光光度计法操作简单，但由于谷物中维生素B含量较低，有共存物质干扰，所以检测结果重复性不高。鉴于人们对于B2的深入研究，此类方法已不能满足研究者的要求。目前，液相色谱法因其分离效率高、速度快、检测灵敏度高、载液流速快、重复性好、对环境污染小、受环境条件影响小等优点被广泛使用。国内测定麦类作物中B2含量的研究已有报导，但不同研究者方法不尽相同，提取方法和色谱条件是影响测定结果的重要原因。

提取方法是定量分析的最重要的环节，提取溶剂及方法会影响终产物的产量和质量，进而干扰后续的定量分析。目前，对维生素B族成分的提取因试验材料和仪器不同而没有统一的提取标准。韩豪等提取黑小麦中维生素B2时，对黑小麦使用脱脂处理，样品用量大；王海燕等通过高峰淀粉酶法提取彩色小麦中维生素B2，操作复杂，需精确调节每个样品的酸碱度，对大批量样品测定费时费力。同时上述方法需要在加热条件下操作完成，但小麦中淀粉含量较高，高温会使淀粉糊化而降低维生素的溶出率。

高效液相色谱(HPLC)技术能对维生素进行快速、灵敏、准确的测定，并通过改变检测器和检测波长提高仪器灵敏度。大量研究利用HPLC技术测定蔬菜、水果、肉类、饮料及乳制品中的维生素含量，但普通小麦中维生素B2的测定研究较少。Batifoulier等利用HPLC测定小麦中维生素B2的含量，测定B2的色谱柱为μBondapak C18(150mm×3.9mm)，该色谱柱实验成本较高。匙赢赢等利用HPLC结合紫外检测器测定麦麸中维生素B2的含量，由于受基体干扰，紫外检测器检测时会出现灵敏度和选择性下降等问题。

目前，我国对维生素B的定量研究主要集中于彩色小麦，其分析样本量较少，没有统一的测定标准，无法为普通小麦维生素B含量的分析打下基础。因此，确立高效准确的维生素B2提取和检测方法，可以为普通小麦维生素B的遗传研究提供可靠的表型鉴定方法。

发明内容

本发明的第一个目的是提供普通小麦中维生素B2的提取方法。

本发明所提供的普通小麦中维生素B2的提取方法，包括如下步骤：

将普通小麦制成全麦粉，所述全麦粉在醋酸钠水溶液中进行酶解；所述酶解结束后的体系经过滤得滤液，即得到维生素B2。

所述维生素B2的提取方法中，所述酶解采用复合酶，所述复合酶可为木瓜蛋白酶、酸性磷酸酶、α-淀粉酶和还原性谷胱甘肽的复合物。

所述复合酶的用量为：所述全麦粉、所述木瓜蛋白酶、所述酸性磷酸酶与所述α-淀粉酶的质量比可为2.5：0.05～0.1g：0.01～0.02g：0.005～0.01g，所述全麦粉与所述还原性谷胱甘肽的用量比为2.5g：250～500μl；

所述全麦粉、所述木瓜蛋白酶、所述酸性磷酸酶、所述α-淀粉酶的质量比具体可为2.5g：0.05g：0.01g：0.005g，所述全麦粉与所述还原性谷胱甘肽的用量比具体可为2.5g：250μl。

所述木瓜蛋白酶的酶活为6000U/mg(如北京索莱宝科技有限公司提供的木瓜蛋白酶，货号为LS003126)，所述酸性磷酸酶的酶活≥0.4U/mg(如Sigma-Aldrich公司提供的酸性磷酸酶，产品目录号为P3627)，所述α-淀粉酶的酶活为30U/mg(如Sigma-Aldrich公司提供的α-淀粉酶，产品目录号为10065)。

所述酶解可采用恒温酶解的方式，温度可为36～38℃，具体可为37℃，时间可为16～18h，具体可为18h，可在转速为180rpm的条件下进行。