[发明专利]一种S-核糖基高半胱氨酸裂解酶基因重组表达载体及其表达方法和应用

权利要求书

1.一种S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括构建S-核糖基高半胱氨酸裂解酶基因重组表达载体的步骤，S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的表达步骤和S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的纯化步骤；

所述S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的表达步骤如下：挑取含有基因重组表达载体pET28a-luxS的大肠杆菌单菌落接入含有卡那霉素的LB液体培养基中，培养至培养物的OD₆₀₀ 值达到 0.6-0.8，向培养物中加入IPTG，继续培养5 ~7h，离心收集菌体，用非变性镍柱结合缓冲液重悬菌体，超声波破碎后离心，得到S-核糖基高半胱氨酸裂解酶粗蛋白；

所述S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的纯化步骤如下：S-核糖基高半胱氨酸裂解酶粗蛋白采用镍亲和层析柱进行纯化，先用非变性镍柱洗脱缓冲液Ⅰ洗脱，然后采用非变性镍柱洗脱缓冲液Ⅱ洗脱，再用非变性镍柱洗脱缓冲液Ⅲ洗脱，去除非特异性结合的杂蛋白；最后用非变性镍柱洗脱缓冲液Ⅳ，收集洗脱液，SDS-PAGE 检测洗脱液中样品纯度，得到纯化后的S-核糖基高半胱氨酸裂解酶；

所述缓冲液Ⅰ为50 mM NaH₂PO₄，500 mM NaCl，100 mM imidazole，pH 8.0；

所述缓冲液Ⅱ为50 mM NaH₂PO₄，500 mM NaCl，150 mM imidazole，pH 8.0；

所述缓冲液Ⅲ为50 mM NaH₂PO₄，500 mM NaCl，200 mM imidazole，pH 8.0；

所述缓冲液Ⅳ为50 mM NaH₂PO₄，500 mM NaCl，250 mM imidazole，pH 8.0；

所述LuxS基因来源于植物乳杆菌；

所述非变性镍柱结合缓冲液成分如下：50 mM NaH₂PO₄，500 mM NaCl，20 mMimidazole， pH8.0；

所述S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的纯化中缓冲液Ⅰ洗脱9~11个柱体积，缓冲液Ⅱ洗脱9~11个柱体积，缓冲液Ⅲ洗脱4~6个柱体积，缓冲液Ⅳ洗脱18~22个柱体积。

2.如权利要求1所述的S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的制备方法，其特征在于，所述S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的表达步骤具体操作如下：挑取含有基因重组表达载体pET28a-luxS的大肠杆菌单菌落接入含有卡那霉素45~55 µg/ml的LB液体培养基中，将培养物按照0.8~1.2%接种量接种于500 mL含有卡拉霉素45~55 µg/ml的LB培养基，36~38℃振荡培养，至培养物的OD₆₀₀ 值达到 0.6-0.8，向培养物中加入IPTG至0.8~1.2mM，36~38℃继续培养6~8 h； 4000~6000 rpm 离心5~7 min， 收集菌体，用非变性镍柱结合缓冲液重悬菌体，超声波破碎后离心，得到S-核糖基高半胱氨酸裂解酶粗蛋白。

3.如权利要求1所述的S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的制备方法，其特征在于，所述S-核糖基高半胱氨酸裂解酶在Al³⁺、Ca²⁺和EDTA影响下活性上升，在Cu²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺及甘油作用下活性下降。