[发明专利]提高羊口疮疫苗免疫原性的佐剂及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于免疫疫苗技术领域，具体涉及一种提高羊口疮疫苗免疫原性的佐剂及其制备方法和应用。

背景技术

羊口疮(Orf)，又名羊传染性脓疱、羊传染性脓疱皮炎、羊传染性脓疱口炎，是由羊口疮病毒(Orf virus，0rfV)引起的绵羊和山羊急性、高度接触性、嗜上皮性人兽共患传染病，羊口疮病毒为副痘病毒属成员之一，基因组全长134～139kb，中央编码区(ORFs009-111)较为保守。

感染羊口疮病毒的羊以口唇、舌、鼻、乳房等部位形成丘疹、水疱、脓疱和结成疣状结痂为特征，不同地区分离的病毒抗原性不完全一致。感染羊口疮病毒的羊生产性能下降，采食困难、消瘦并长期带毒，给养羊业及饲养人员的健康带来严重的危害。该病几乎遍布全世界所有养羊的国家和地区，而且我国是该病流行严重的国家，每年感染ORFV的羊不少于500万只。

羊口疮病毒(ORFV)的成熟病毒粒子呈砖形或椭圆形毛线团样外观，外层由较厚的囊膜包裹，与VACV相似也具有IMV、EEV等多种病毒粒子形式(Rziha et al.,2003)。临床预防羊口疮的主要手段是接种疫苗，常用的有灭活苗和细胞弱毒苗，但存在产生抗体水平较低，免疫保护期短，不宜大量生产、储存的缺点。目前对该病尚无特效的治疗方法，只能采取临床外伤处置及支持疗法，在防控上国内外主要采取接种羊口疮弱毒活疫苗进行预防，但这种疫苗仍不能够彻底消除和控制该病，在免疫力和安全性方面均存在一定的缺陷，因此，创制安全、高效的新型疫苗势在必行，新型基因工程疫苗的研究具有重要的意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种提高羊口疮疫苗免疫原性的佐剂及其制备方法和应用，所述佐剂包括可以表达细胞因子IL-2的真核表达质粒，能提高羊口疮疫苗免疫原性，对新型羊口疮疫苗的研究具有重要的意义。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

提高羊口疮疫苗免疫原性的佐剂，所述佐剂包括真核表达质粒pVAX1-IL-2。

进一步，所述真核表达质粒pVAX1-IL-2中含有山羊IL-2的全基因编码序列，如SEQ ID NO:1所示。

提高羊口疮疫苗免疫原性的佐剂，所述佐剂包括能表达IL-2基因的真核表达质粒。

白细胞介素-2(Interleukin-2，IL-2)是一种最早发现的具有广泛生物活性的细胞因子，它能刺激T、B细胞生长增殖，激活T细胞分泌IFN-γ、CSF等，并增强Tc(Cytotoxic T cel1)、NK、巨噬细胞的细胞毒活性，增强抗原提呈作用，是调节机体诱导免疫的重要细胞因子。由于它能够有效地提高免疫功能，医学上已用于预防和治疗一些常规方法难以治疗的疾病，如肿瘤等。

临床预防羊口疮的主要手段是接种疫苗，常用的有灭活苗和细胞弱毒苗，但存在产生抗体水平较低，免疫保护期短，不宜大量生产、储存的缺点，不易大规模制备等原因而未能够进入临床应用。因此，新型基因工程疫苗的研究具有重要的意义，山羊IL-2能够有效地提高免疫功能，通过构建其真核表达质粒作为DNA疫苗来预防羊口疮能够有效刺激机体产生特异性的细胞免疫和体液免疫应答，且核酸疫苗具有易于制备，具有重要的临床意义。

pVAX1载体是用于核酸疫苗的研究较多的载体之一，是美国FDA认可的可用于人的核酸疫苗研究的载体，其特征是携带强启动子Pc-MV和BGH ploy A信号，允许在大肠杆菌中进行高拷贝复制和在哺乳动物细胞中高水平瞬时表达的蛋白。pVAX1载体是在pcDNA3.1载体的基础上改造而成，该载体使用卡那霉素抗性基因替代pcDNA3.1载体的氨苄抗性基因，减少和人类基因重组的可能。由于pVAX1载体是一种非融合载体，要求插入序列中5'端含一个Kozak序列、起始密码子ATG和终止密码子TGA/TAG/TAA，以增强目的基因表达效率。

进一步，所述真核表达质粒pVAX1-IL-2的OD_260-280数值为1.8-2.0。

本发明的目的之二在于提供一种所述的佐剂的制备方法，将IL-2基因构建到真核表达载体pVAX1中，得基因真核表达质粒pVAX1-IL-2。

进一步，所述的制备方法包括以下步骤：

1)提取山羊淋巴细胞中RNA，进行PCR目的基因IL-2的扩增；

2)将得到的IL-2基因与pMD19-T载体进行连接，再经转化得重组质粒；

3)采用Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ对pVAX1载体和重组质粒进行双酶切，得IL-2基因目的片段和pVAX1载体片段；