[发明专利]一种可溶性草酸氧化酶的制备方法及其应用

说明书

本发明公开了一种用于高效表达可溶性草酸脱羧酶的重组表达框，同时发明一种能在大肠杆菌中高效表达可溶性且有活性的草酸氧化酶的制备方法，并将细胞破碎液上清通过硫酸铵沉淀，用柠檬酸‑柠檬酸钠缓冲液复溶后的含草酸氧化酶的溶液，直接用于草酸脱羧酶活力测定。这种测定方法与传统的方法如市售的测定草酸的试剂盒和HPLC法相比，精确度和灵敏度较高，耗时短，成本低，易于通过酶标仪对大量的样品进行高通量测定，具有很好的实用性。本发明中制备的草酸氧化酶还可用于其它以草酸为底物或产物的酶的活力的测定，还可用于人和动物的血液和尿液以及各种含草酸的样品中草酸含量的测定。

技术领域

本发明涉及重组蛋白表达领域，具体涉及一种可溶性草酸氧化酶的制备方法及其应用。

背景技术

草酸氧化酶(Oxalate oxidase，OxO,EC1.2.3.4)主要存在于植物中，能够将草酸分解成二氧化碳和过氧化氢。在草酸积累相关疾病的诊断、体内草酸的清除等方面具有很大的应用潜力。

目前，草酸氧化酶的生产主要有植物组织提取和重组表达，其中，植物提取方法受原料的影响比较大，含量较低，提取工艺复杂，收率低。植物提取的酶，一般是与植物细胞壁稳定的结合，是固体不溶物，不便于其在草酸检测中的应用。重组表达的草酸氧化酶，目前只有大麦、小麦和白腐菌的草酸氧化酶在毕赤酵母中实现了分泌表达，因草酸氧化酶一般都是6聚体蛋白，分子量比较大，单体分子量一般在24kDa左右，总分子量一般超过140kDa，结构比较复杂，折叠成为正确的结构比较困难，大的蛋白分泌表达比较难，效率低；另外，酵母发酵的发酵液中的成分与草酸氧化酶分子结合，会严重影响草酸氧化酶的活性，必须纯化到较高的纯度才有活性，而且表达量较低，发酵周期长，总的生产成本较高。虽然也有在大肠杆菌中表达大麦和小麦草酸氧化酶的报道，但表达量很低，且表达的草酸氧化酶形成包涵体，纯化工艺复杂且活性非常低。总体上，草酸氧化酶重组表达的种类较少，表达量偏低，生产成本较高，限制了其在诊断和治疗与草酸相关的疾病方面的应用。

草酸脱羧酶(Oxalate decarboxylase,OXDC,EC4.1.1.2)是一种包含Mn²⁺的草酸降解酶，主要存在于真菌或一些细菌中，它能够在没有其他辅因子的作用下，直接将草酸降解生成甲酸和CO₂。目前测定草酸脱羧酶活力的方法主要有HPLC法，分光光度法，测压发酶法等，可以通过测定底物草酸分解产生的甲酸的量、CO₂的量或草酸分解减少的量来计算OXDC的活性。甲酸的测定可以用HPLC或甲酸脱氢酶法，CO₂的测定可以通过测压计法和酶法，草酸的测定可以通过HPLC法(廖贤平等.武警医学院学报,19(1):47-50)，次甲基蓝-重铬酸钾法(梁磊等.分析测试学报,2006,25(1):98-101)和滴定法。

HPLC法测定剩余草酸或甲酸对仪器和样品要求比较高，测定样品效率较低，一次只能测定一个样品，成本比较高，不利于高通量测定大量的样品，不利于推广；用酶法测定甲酸法测定需要用到氧化型辅酶I和甲酸脱氢酶，成本高，耗时长。测压计测定CO₂法操作繁琐，对仪器要求较高，不易于大批量测定多个样品；酶法测定CO₂含量方法会用到磷酸烯醇式丙酮酸、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、NADH和苹果酸脱氢酶等较为昂贵的试剂，同样存在成本高和耗时长的问题；次甲基蓝-重铬酸钾法测定草酸试剂比较便宜，方法较为简单，但该方法灵敏度较差，测定草酸的浓度范围较窄(0-0.08mM)；目前用草酸氧化酶法，用纯酶的成本比较高，用植物组织如大麦麦麸提取的草酸氧化酶是与植物细胞壁紧密结合的，成分比较复杂，粗酶的活性低，不溶解于buffer，不利于催化反应对显色有干扰，草酸测定的线性范围较窄(0-0.08mM)。滴定法测定草酸是比较老的方法，同样存在灵敏度差，线性范围较窄，受样品pH干扰大，耗时，不能实现高通量测定等缺点。

目前，草酸氧化酶很难实现重组表达，大肠杆菌中表达的草酸氧化酶都形成包涵体，绝大多数酶没有活力，目前市场上草酸氧化酶的种类很少，产量较低，价格高，植物组织提取的草酸氧化酶活力低，工艺复杂，实用性差，这些都制约了草酸氧化酶法的应用。