[发明专利]一种京尼平的制备方法

说明书

本发明公开了一种京尼平的制备方法。所述制备方法利用氨基化修饰的纳米SiO₂颗粒与β‑葡萄糖苷酶经戊二醛交联得到纳米固定化酶，然后以栀子苷为底物，利用纳米固定化酶高效水解得到京尼平。本发明制备的纳米固定化酶在反应系统中分散性好且能够重复使用，京尼平的产率和纯度高，因而能够有效地制备京尼平。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种京尼平的制备方法。

背景技术

游离酶在酶反应的最适条件下进行催化，存在着容易失活、反应后不能回收等缺陷，且游离酶不易与产物分开，影响产品的提纯和质量。酶的固定化能有效地解决上述问题。固定化酶不仅具有酶的催化特性，而且反应后可用过滤或者离心的方式与反应液分离，可以反复使用。酶可以采用不同的载体和方法进行固定，酶在固定化后，酶学性质包括温度、pH、稳定性等与游离酶有很大的差别。纳米SiO₂颗粒的粒径范围在1-100nm，具有分散性好、稳定性高、比表面积大、生物相容性高等优异的性质。

京尼平是栀子苷在β-葡萄糖苷酶的作用下的水解产物，是一种新型的生物交联剂，可与多种生物大分子进行交联，如明胶、壳聚糖、蛋白质、胶原蛋白等。京尼平的药效高于栀子苷，具有抗感染、肝脏保护等作用。目前，京尼平的生物制备主要依靠游离β-葡萄糖苷酶和微生物的反应来实现。在游离酶的反应体系中，京尼平容易与氨基酸或蛋白质生成可溶性的蓝色色素，因而影响了产品质量，降低了产率(Gong G H,et al.Purificationand characterization of a β-glucosidase from Aspergillus niger and itsapplication in the hydrolysis of geniposide to genipin[J].Journal ofMicrobiology and Biotechnology,2014,24(6):788-794.)。在微生物的反应体系中，虽不存在京尼平与大分子的交联反应，但反应速率较慢(Dong Y,et al.Biotransformation ofgeniposide in Gardenia jasminoides to genipin by Trichoderma harzianum CGMCC2979[J].Chinese Journal of Catalysis,2014,35(9):1534-1546.)。常见的固定化载体有壳聚糖、海藻酸钙等，与纳米材料相比，存在固定化酶分散性差、载酶量低等问题(Yang YS,et al.Transformation of geniposide into genipin by immobilized β-glucosidase in a two-phase aqueous-organic system[J].Molecules,2011,16(5):4295-4304.)。

发明内容

本发明的目的是提供一种京尼平的制备方法，利用以纳米SiO₂颗粒为载体，戊二醛为交联剂，与β-葡萄糖苷酶共价结合制备得到的纳米固定化酶，高效水解栀子苷，制备京尼平。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种京尼平的制备方法，具体步骤如下：

步骤1，将氨基化修饰的纳米SiO₂颗粒与戊二醛混合，得到Nano-SiO₂@NH₂@CHO，加入β-葡萄糖苷酶，在4℃下进行交联，交联结束后，离心收集纳米固定化酶；

步骤2，将栀子苷溶于pH为6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中，加入纳米固定化酶，在50℃下反应1-3h，反应结束后离心，分离上清液得到京尼平，分离得到的纳米固定化酶重复使用。

优选地，步骤1中，交联时间为24h。