[发明专利]一种胎盘造血干细胞的制备方法

权利要求书

1.一种胎盘造血干细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括胎盘预处理、胎盘血收集、胎盘造血干细胞的提纯，步骤为：

1）、胎盘预处理：在无菌环境下，用无菌镊子将胎盘从采集盒中夹出放入事先准备好的无菌铁盒中，且用无菌钳子夹住胎盘表面脐带的一端，去除胎盘表面附着的羊膜、血块，用磷酸盐缓冲液PBS冲洗胎盘表面并浸泡一分钟，缓冲液量应没过整个胎盘，冲洗胎盘次数在2次以上，且每冲洗一次均应另换一个经过灭菌的容器，磷酸盐缓冲液PBS中添加组合抗生素；

2）、胎盘血收集：清洗完胎盘表面后，用生理盐水和体积分数10%的血液保存液的混合液用一次性注射器自脐带脐动脉进针推入胎盘血管，收集流出的胎盘血液，将收集的血液转移至离心管内；

继续用含质量浓度为10g/L的AMD3100的生理盐水灌入胎盘，用脐带夹夹紧脐动脉，孵育30分钟后，收集冲洗液；

3）、胎盘造血干细胞的提纯：将第一次和第二次收集的胎盘血混合后，按羟乙基淀粉与胎盘血比例为4:1加入羟乙基淀粉混合15分钟，分别分装至离心管进行离心，离心条件为：离心速率为50g/min，升速5档，降速1档，离心时间15min，离心结束后收集上清液，将上清液再次离心，离心条件为：转速2000rpm/min，加速7档，降速4档，离心时间10min，离心结束后收集离心管底部有核细胞；用RPMI1640混合悬浮离心后的细胞，用常规检测方法进行造血干细胞的计数、活性检测；在细胞悬液中加入甲基纤维素培养基中，并振荡至气泡消散，接种于细胞培养板中，放入37℃，5%浓度的二氧化碳培养箱中培养，定期观察细胞集落形成状态。

2.如权利要求1所述的胎盘造血干细胞的制备方法，其特征在于，所述胎盘预处理的磷酸盐缓冲液PBS的组分为：1000ml灭菌超纯水中加入氯化钠8.5g、磷酸氢二钠2.85g、磷酸二氢钾0.27g、氯化钾0.2g，其中缓冲液中添加抗生素组合青霉素、链霉素混合液（双抗）、庆大霉素、两性霉素B分别添加浓度为3%、2%、1%。