[发明专利]铜绿假单胞菌pyoS5基因敲除突变株及构建方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程菌株技术领域，特别涉及一种铜绿假单胞菌pyoS5基因敲除突变株，还涉及此菌株的构建方法及应用。

背景技术

铜绿假单胞菌属于革兰氏阴性菌，是一种多功能代谢普遍存在于周围环境中的细菌种类。它能够寄生于各种植物及动物宿主，引起人类的机会性感染。量化基因表达水平已成为大多数分子生物学实验室的主要生物学研究技术，通过测量细胞中RNA的含量，可以确定特定基因的表达程度。转录组测序是在基因转录水平，研究在某个时间点的组织中所有转录本的表达情况，根据相同部位相同时间点不同含量的个体间的分析，可以批量分析影响毒力的差异表达基因，同样可以根据得到的差异基因来构建多基因调控网络。

在分子生物学领域，很多方法都可以用来进行靶基因的定量研究。实时荧光定量PCR就是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。cDNA芯片和差异显示是两种最常用的高通量筛选差异表达基因的技术。将实时荧光定量PCR和高通量方法的结果相互比较就能对这个基因是否真的存在表达差异进行确证。

基因敲除是基因打靶技术的一种，类似于基因的同源重组。指外源DNA与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，从而代替受体细胞基因组中相同/相似的基因序列，整合入受体细胞的基因组中，令特定的基因功能丧失，并进一步研究可能对相关生命现象造成的影响，进而推测该基因的生物学功能。自杀质粒(suicide plasmid)通常为R质粒的衍生质粒，常有宿主范围广的特点，具有接合转移基因。它的复制需要一种特殊的蛋白，大多数细菌不产生这种蛋白质，当进入寄主细胞时，要么不能复制，被消除，要么被整合入染色体上，和染色体一起复制。利用自杀质粒的这个特点，将基因工程技术构建的基因缺失的DNA片断，克隆入自杀质粒，利用缺失基因两端的同源片断，定位自杀质粒的整合位点。利用同源性DNA片断可发生重组的原理，构建精确基因缺失菌株。铜绿假单胞菌的敲除菌株鲜有研究，特别是pyoS5基因的敲除菌株目前还未见报道。

发明内容

为了解决以上现有技术中铜绿假单胞菌的敲除菌株鲜有研究的问题，本申请提供了一种铜绿假单胞菌pyoS5基因敲除突变株。

根据铜绿假单胞菌强弱毒菌株的比较转录组学数据以及荧光定量PCR验证结果，分析相关数据库，找出显著性的差异表达基因。利用基因敲除的方法构建差异基因的缺失株，即构建目的基因打靶片段，引入外源性自杀质粒，进行双交换同源重组，通过PCR技术筛选获得pyoS5基因被庆大霉素抗性基因Gm取代的克隆，以进行后续研究差异基因与毒力的相关性。

本发明还涉及铜绿假单胞菌pyoS5基因敲除突变株的构建方法。

本发明还涉及铜绿假单胞菌pyoS5基因敲除突变株的应用。

本发明是通过以下步骤得到的：

一种铜绿假单胞菌pyoS5基因敲除突变株，构建方法如下：

(1)从铜绿假单胞菌细菌基因组上扩增pyoS5基因的上下游同源重组臂，同时克隆到pUC19质粒的多克隆位点区域，获得克隆pUC19-ΔpyoS5；

(2)将从pJQ200SK质粒上扩增得到的庆大霉素抗性基因Gm克隆到上下游同源臂间，获得pUC19-ΔpyoS5::Gm质粒；

(3)打靶片段上游同源臂-庆大霉素抗性基因-下游同源臂，经亚克隆转入自杀质粒pCVD442，获得打靶质粒pCVD442-ΔpyoS5::Gm；

(4)pCVD442-ΔpyoS5::Gm转入大肠杆菌E.coliβ2155，获得供体菌β2155/pCVD442-ΔpyoS5::Gm，与受体菌11092618进行接合，经过培养、筛选获得pyoS5基因被Gm抗性基因取代的铜绿假单胞菌pyoS5基因敲除突变株11092618ΔpyoS5。构建方法技术路线如图1所示。

本发明铜绿假单胞菌11092618菌株pyoS5基因敲除突变株具有以下特征：所述突变株属于假单胞菌科、假单胞菌属，属于革兰氏阴性菌；专性需氧，呈球杆状或线状，成对或短链状排列，菌体的一端有单鞭毛，无芽胞；在液体培养基中则呈浑浊状生长；在普通琼脂培养基上生长16～18h可以见到扁平、湿润的菌落；在血琼脂平板上生长时可以见到在菌落的周围有溶血环，菌落呈金属光泽。

所述的铜绿假单胞菌pyoS5基因敲除突变株，步骤(1)中所述上游同源重组臂的扩增引物碱基序列见序列表中序列1、2，下游同源重组臂的扩增引物碱基序列见序列表中序列3、4，庆大霉素抗性基因Gm的扩增引物碱基序列见序列表中序列5、6。