[发明专利]基于相位调制的激光扫描饱和结构光照明的显微方法及装置

说明书

技术领域

本发明属于共聚焦显微领域，特别涉及一种基于相位调制的激光扫描饱和结构光照明的显微方法及装置。

背景技术

共聚焦显微镜利用激光束经光学系统形成点光源对物镜焦平面处的样品进行扫描。焦平面上的被照射点在探测针孔处成像，而焦平面以外的点并不会在探测针孔处成像。被照射点的图像信息由探测针孔后的光电探测器逐点接收，迅速在计算机监视屏上形成荧光图像，这样得到的共聚焦图像就是样品内物镜焦平面的光学横切面。但是根据衍射理论，显微镜的分辨能力与波长和数值孔径有关，存在衍射极限，虽然减小波长和增大数值孔径都能提高分辨率，但都无法突破衍射极限，不能真正大幅度地提高分辨率。

近年来，一些突破衍射极限的超分辨显微方法逐渐提出。其中受激发射损耗显微镜(STED)通过分子态的饱和损耗可实现超分辨，但需使用大功率激光器提高分辨率，很容易发生荧光漂白现象；随机光学重构显微镜(STORM)则是通过牺牲时间分辨率来换取空间分辨率，不能实现对样品像的快速获取。与受激发射损耗显微镜(STED)和随机光学重构显微镜(STORM)相比，结构光照明显微镜(SIM)的照明只需要单波长光源，且不需要特殊的荧光探针。通过结构光照明，可以将样品的高频部分移到光学系统光学传递函数所限制的通带内，并随后合并频率信息。由于照明的频率亦被物镜的数值孔径所限制，传统的结构光照明显微镜仅仅能够提升两倍的分辨率。为了克服两倍分辨率提升的上限，饱和结构光照明显微镜(SSIM)利用饱和激发态所产生的非线性向照明结构光引入高次谐波，所以可以获取高于光学传递函数通带两倍的频率。但是由于产生非线性相应有极高的光功率要求，饱和结构光照明非常容易产生光致漂白现象，甚至造成固定样品的损坏，这就解释了饱和结构光照明不能广泛的应用于生物样品观测的事实。

发明内容

本发明在共聚焦显微镜的基础上，提出了一种基于相位调制的激光扫描饱和结构光照明显微方法及装置，可在提升成像分辨率的情况下同时降低所需成像光强，从而降低了实验系统对光源的要求，同时减少了光致漂白的产生。本装置通过对激光光源进行相位调制聚焦产生双峰激发点扩散函数，沿着不同方向进行扫描，将高频部分引入所获取的像，从而提高了结构光照明显微成像的横向和纵向分辨率。同时采用激光点扫描照明，相对于宽场饱和结构光照明显微成像大大降低了照明所需光强，同时亦可获取足够的高频分量。

相对于其他超分辨成像显微镜，本发明是基于共聚焦显微镜，其结构简单，便于操作，通过接收激光点扫描激发的荧光能够实现超分辨显微成像，可用于光学显微成像领域。

一种基于相位调制的激光扫描饱和结构光照明的显微方法，包括步骤：

1)将准直后的照明光束转换为线偏光；

2)在所述的线偏光上加载第一方向的0-π相位，并调整线偏光的偏振方向；

3)利用偏振方向调整后的线偏光对样品进行扫描，形成激发样品产生荧光的第一激光扫描饱和结构光照明图案，并收集得到第一荧光信号；

4)在所述的线偏光上加载第二方向的0-π相位，并适应调整线偏光的偏振方向；

5)利用偏振方向调整后的线偏光对样品进行扫描，形成激发样品产生荧光的第二激光扫描饱和结构光照明图案，并收集得到第二荧光信号；

6)对所述的第一荧光信号和第二荧光信号进行处理，得到横向分辨率提升的超分辨图像。

本发明中，可采用具有0-π相位图案的空间光调制器或者0-π位相板在线偏光上加载0-π相位。

优选的，在步骤2)中，利用具有0-π相位图案的空间光调制器在所述的线偏光上加载第一方向的0-π相位；在步骤4)中，转动所述空间光调制器上的0-π相位图案，在所述的线偏光上加载第二方向的0-π相位。

并列优选实施的，在步骤2)中，利用0-π位相板在所述的线偏光上加载第一方向的0-π相位；在步骤4)中，转动0-π位相板，在所述的线偏光上加载第二方向的0-π相位。

优选的，在所述的线偏光上加载第二方向的0-π相位时，转动的角度为60°或/和120°，此角度仅为本发明优选的实施方式之一，也可以采用其他的转动角度，转动角度只要满足转动的次数和未知数的个数相同即可解出方程，具体的角度并没有严格的要求。

本发明中，根据复原所用的级次以及对各个方向分辨率的要求选择扫描角度，依次加载不同角度方向的0-π相位，得到不同角度方向对应的第二荧光信号。