[发明专利]可溶性透明质酸酶的大规模生产

权利要求书

1.一种收获的细胞培养液，包含所收获的具有大于5000单位/mL酶活性的可溶性重组人PH20，其中所收获的细胞培养液是指从细胞、细胞碎片和集合物分离的液体，其未进行进一步纯化或浓缩。

2.权利要求1的收获的细胞培养液，其中所述酶活性是10,000单位/mL、12,000单位/mL、14,000单位/mL、16,000单位/mL、18,000单位/mL、20,000单位/mL、22,000单位/mL或24,000单位/mL。

3.权利要求1或2的收获的细胞培养液，其中编码可溶性人PH20的细胞是DG44CHO细胞。

4.权利要求1或2的收获的细胞培养液，其中所述可溶性重组人PH20的氨基酸序列为SEQ ID NOs:4-9之一的序列或具有与SEQ ID NOs:4-9之一的序列98％、99％或更高序列相同性，其中所述序列相同性根据全部序列的长度确定。

5.权利要求1或2的收获的细胞培养液，其中所述可溶性重组人PH20的氨基酸序列为SEQ ID NOs:4-9之一的序列。

6.权利要求1或2的收获的细胞培养液，其中编码可溶性重组人PH20的细胞是DG44CHO细胞；且所述可溶性重组人PH20的氨基酸序列为SEQ ID NOs:4-9之一的序列。

7.权利要求1或2的收获的细胞培养液，通过包括以下的方法制备：

a)用编码可溶性重组人PH20的细胞的接种物接种生物反应器中的细胞培养基以产生细胞培养物，其中：

所述细胞包含150至300个拷贝的编码可溶性重组人PH20的核酸；

所述生物反应器含有至少100升的细胞培养物；

每100升细胞培养物中接种了约10¹⁰-10¹¹个细胞；以及

将所述细胞在设定的温度培养；

b)用第一加料培养基给细胞加料，所述培养基含有葡萄糖、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、人胰岛素和酵母提取物，其量足以提高细胞生长及峰值细胞密度并提高可溶性重组人PH20的合成，其中将所述加料培养基以细胞培养物体积的0.5％至20％的体积加入到该培养物中；

c)用第二加料培养基给细胞加料，所述培养基含有葡萄糖、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、酵母提取物和丁酸钠，其量足以提高可溶性重组人PH20的合成和诱导细胞周期停滞；以及

将温度相对于步骤a)中的温度降低至足以提高细胞周期停滞、提高细胞生存力和使可溶性透明质酸酶稳定的温度；其中：

L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的量相对于步骤b)中L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的量是降低的；

酵母提取物的量相对于步骤b)中酵母提取物的量是增加的；以及

将所述加料培养基以细胞培养物体积的0.5％至20％的体积加入到该培养物中；

d)用第三加料培养基给细胞加料，所述培养基含有葡萄糖、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、酵母提取物和丁酸钠，其量足以提高可溶性重组人PH20的合成和提高细胞周期停滞，以及

将温度相对于步骤c)中的温度降低至足以提高细胞周期停滞、提高细胞生存力以及使可溶性透明质酸酶稳定的温度；其中：

L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的量相对于步骤c)中L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的量是降低的；

酵母提取物、葡萄糖和丁酸钠的量相对于步骤c)中酵母提取物、葡萄糖和丁酸钠的量是增加的；以及

将所述加料培养基以细胞培养物体积的0.5％至20％的体积加入到该培养物中；

e)用第四加料培养基给细胞加料，所述培养基含有葡萄糖、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、酵母提取物和丁酸钠，其量足以提高可溶性重组人PH20的合成和提高细胞周期停滞，以及

将温度相对于步骤d)中的温度降低至足以提高细胞周期停滞、提高细胞生存力以及使可溶性透明质酸酶稳定的温度；其中：

L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的量相对于步骤d)中L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的量是降低的；

丁酸钠的量相对于步骤d)中丁酸钠的量是降低的；以及

将所述加料培养基以细胞培养物体积的0.5％至20％的体积加入到该培养物中；

f)继续培养所述细胞直至生存力跌落到低于50％；

g)获得收获细胞培养液。

8.权利要求7的收获的细胞培养液，其中步骤a)中的温度是37℃。