[发明专利]重组胶原蛋白复合硫酸软骨素和聚乙二醇的骨修复凝胶

说明书

本发明公开了重组胶原蛋白复合硫酸软骨素和聚乙二醇的骨修复凝胶，主要通过复合重组胶原蛋白、硫酸软骨素、以及聚乙二醇三种材料，利用三者之间的化学反应交联形成，相比较从动物中提取的天然胶原蛋白，重组胶原蛋白具有低抗原性，彻底杜绝了动物源材料所不可避免的病毒隐患，保证了凝胶材料在临床使用中的安全性，本发明所提供的凝胶的制备过程中没有任何有毒物质的引入，所用的原料均无生物学毒性，并且所加的硫酸软骨素具有止痛，促进软骨再生的功效。本发明制备的复合水凝胶具备良好的生物相容性和可降解性，并对骨缺损起到良好的修复作用，在生物材料领域具有极大的潜力和应用价值。

技术领域

本发明涉及蛋白质工程，医用生物材料制备技术领域，具体为重组胶原蛋白复合硫酸软骨素和聚乙二醇的骨修复凝胶。

背景技术

骨缺损是临床常见病，也是骨科治疗中的一个技术难题。目前，治疗骨缺损的方法主要包括骨移植、组织工程技术和基因治疗法及生长因子、物理治疗法的辅助治疗等，但仍没有彻底的骨缺损修复方法。因此寻找一种理想的骨缺损修复材料具有重要意义。

水凝胶具有良好的生物相容性及生物可降解性，具备类细胞外基质的仿生特性及三维水化网状结构，有利于细胞的迁移和生长，因此是移植细胞或缓释生长因子的适宜载体。因此将水凝胶体系作为一种组织工程骨缺损修复材料具有重要应用前景。

胶原蛋白主要分布在哺乳动物的结缔组织中，对动物和人体皮肤、血管、骨骼、筋腱、牙齿和软骨的形成都十分重要，是这些结缔组织的主要物质基础。畜禽源动物组织是人们获取天然胶原蛋白及其胶原肽的主要途径，但由于相关畜类疾病和某些宗教信仰使得人们对陆生哺乳动物胶原蛋白的获取受到限制。重组胶原蛋白是通过生物基因工程技术在大肠杆菌体系中培养、分离和纯化的一种蛋白。和天然动物胶原蛋白一样，重组胶原蛋白同样有着典型的三股螺旋结构以及(Gly-Xaa-Yaa)n重复序列、良好的生物相容性、生物降解性。自动物体提取的胶原蛋白，存在水溶性不佳，可加工性弱，质量不稳定等缺陷。而且,动物来源的胶原蛋白难以排除疯牛病，口蹄疫等病毒风险。重组胶原蛋白没有这些问题。

发明内容

本发明的目的在于提供重组胶原蛋白复合硫酸软骨素和聚乙二醇的骨修复凝胶，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：重组胶原蛋白复合硫酸软骨素和聚乙二醇的骨修复凝胶,主要包括重组胶原蛋白、硫酸软骨素以及聚乙二醇三种材料。

优选的，其制备方法包括以下步骤：

A、利用生物基因工程技术制备重组胶原蛋白，包括以下步骤：

a、合成编码重组胶原蛋白的核酸，构建导入核酸的质粒，将质粒转化大肠杆菌BL21-DE3菌株；

b、在大肠杆菌BL21-DE3菌株中表达重组胶原蛋白，主要包括以下步骤：

(1)将少量菌液加入50ml含氨苄西林钠100μg/ml的LB培养基中，置于37℃摇床过夜培养；

(2)然后将培养基转移至1L含氨苄西林钠100μg/ml的LB培养基中，在37℃环境下继续扩大培养；

(3)紫外分光光度计测量菌液在波长600nm处的OD值，当菌液的OD值在0.6～0.8时，加入1mM IPTG同时降低摇床温度至20℃-25℃继续培养8h-10h诱导蛋白表达，将菌液离心，收集细胞沉淀；

c、重组胶原蛋白的纯化，主要包括以下步骤：

(1)将离心后的菌体用缓冲液A使其溶解，缓冲液A由20mM咪唑、20mM磷酸钠、0.5M氯化钠组成，其pH为7.4；