[发明专利]重组胶原蛋白复合硫酸软骨素和聚乙二醇的骨修复凝胶

权利要求书

1.重组胶原蛋白复合硫酸软骨素和聚乙二醇的骨修复凝胶，其特征在于：由重组胶原蛋白、硫酸软骨素以及聚乙二醇三种材料组成；所述硫酸软骨素为ADH修饰的硫酸软骨素，所述聚乙二醇为活性酯聚乙二醇活性酯NHS-PEG-NHS，所述重组胶原蛋白复合硫酸软骨素和聚乙二醇的骨修复凝胶由活性酯聚乙二醇活性酯与ADH修饰的硫酸软骨素以及重组胶原蛋白上的氨基反应生成酰胺键制备获得；所述重组胶原蛋白利用生物基因工程技术制备，包括以下步骤：

a、合成编码重组胶原蛋白的核酸，构建导入核酸的质粒，将质粒转化大肠杆菌BL21-DE3菌株；

b、在大肠杆菌BL21-DE3菌株中表达重组胶原蛋白，包括以下步骤：

（1）将步骤a所述菌株的菌液加入50mL 含氨苄西林钠100μg/mL 的LB培养基中，置于37℃摇床过夜培养；

（2）然后将培养基转移至1L含氨苄西林钠100μg/mL 的LB培养基中，在37℃环境下继续扩大培养；

（3）紫外分光光度计测量菌液在波长600nm处的OD值，当菌液的OD值在0.6～0.8时，加入1mM IPTG同时降低摇床温度至20℃-25℃继续培养8h-10h诱导蛋白表达，将菌液离心，收集细胞沉淀；

c、重组胶原蛋白的纯化，包括以下步骤：

（1）将离心后的菌体用缓冲液A使其溶解，缓冲液A由20mM咪唑、20mM磷酸钠、0.5M氯化钠组成，其pH为7.4；

（2）将细菌悬浊液放入超声波细胞破碎仪中进行细胞破碎，即可释放出蛋白并且蛋白会溶于缓冲液A中，其中细胞破碎条件：用2s超声、2s间歇的条件破碎100分钟，超声时将细菌悬浊液放于冰浴中，将破碎完的悬浊液再次离心，使细胞碎片与蛋白溶液分离，其中离心条件：离心速率10000-15000r/min，离心温度2℃-6℃，离心时间20min-30min；

（3）收集上清液，此即为粗蛋白溶液，通过Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱进行纯化，将上清蛋白液加入镍柱，用结合缓冲液洗6～8次后再用高浓度咪唑洗脱液，其中结合缓冲液由30mM咪唑、0.5M NaCl、20mM Na₂HPO₄，组成，其pH为7.4；高浓度咪唑洗脱液由500mM咪唑、0.5M NaCl、20mM Na₂HPO₄，组成，其pH为7.4，将蛋白洗脱，收集蛋白洗脱液后用甘氨酸透析液于4℃透析4次；

（4）紫外分光光度计测得蛋白液浓度，计算蛋白含量后用胰蛋白酶按一定质量比酶切蛋白得目标蛋白，蛋白液用20mM pH为7.4的PBS透析，收集透析后的蛋白液冷冻干燥后得到蛋白CL冻干粉，冻干粉于-10℃--20℃保存。

2.如权利要求1所述的重组胶原蛋白复合硫酸软骨素和聚乙二醇的骨修复凝胶的制备方法，其特征在于，其制备方法包括以下步骤：

A、制备ADH修饰硫酸软骨素，其制备方法包括以下步骤：将硫酸软骨素溶于蒸馏水中，加入1-3-二甲氨基丙基-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，将pH调至5.5，然后加入己二酸二酰肼并调节pH调至6.0，搅拌反应24h，将产物在蒸馏水中透析3天，冷冻干燥后与室温保存；

B、将硫酸软骨素和重组胶原蛋白混合配置成溶液，配制活性酯聚乙二醇活性酯NHS-PEG-NHS溶液；其中硫酸软骨素浓度为100mg/mL 、重组胶原蛋白浓度为40mg/mL 、活性酯聚乙二醇活性酯NHS-PEG-NHS浓度为160mg/mL ；

C、将步骤B中的两种溶液按体积比1:1混合搅拌均匀后静置于25℃形成凝胶。