[发明专利]一种快速定量评价不同抗菌药物作用效果的方法

说明书

本发明涉及药物筛选技术领域，具体的说是一种采用重水(D₂O)标记结合活体单细胞拉曼光谱技术快速定量评价不同抗菌药物的方法。利用重水标记和待检测药物培养抗病菌，再通过拉曼光谱检测培养中单个细胞在一段时间下C‑D峰(1800‑2500cm^‑1)变化，而后通过光谱C‑D峰(1800‑2500cm^‑1)变化计算获得单个细胞C‑D‑ratio，再由C‑D‑ratio获得不同时间点的ΔC‑D‑ratio，进而获得待检测药物最小抑制代谢浓度MIC‑MA，即定量的判别待检测药物敏感性。本发明操作有操作简单、样品用量少、时间相对较短、成本低的优点，进而利用本发明采用的活体单细胞拉曼光谱技术结合重水标记技术可以用于评价并筛选对目标细胞造成不同代谢抑制程度的药物，并且可以在时间轴跨度上评价药物作用水平，在细菌，哺乳动物细胞等领域具有普适性，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明涉及药物筛选技术领域，具体的说是一种采用重水(D₂O)标记结合活体单细胞拉曼光谱技术快速定量评价不同抗菌药物作用效果的方法。

背景技术

随着抗菌药物包括抗生素等的不断普及，抗生素滥用以及细菌耐药性问题已经日趋明显，严重感染中对大多数常用抗生素具有耐药性的细菌的出现导致无药可用的情况已经成为21世纪所面临的全球重大卫生安全问题。传统的抗菌剂评价标准分为基于细胞生长的手段和不基于细胞生长的手段。其中基于细胞生长的药物评价体系包括琼脂扩散法、薄层色谱生物自显影、梯度稀释法等，这类方法依赖于细胞分裂增殖，因此通常需要较长时间(常大于16h)才能完成。同时采用最小抑制浓度(MIC) 作为评判指标，其定义为细胞暴露在药物18-24h后的无明显生长时的药物浓度，但是通常细胞不生长不代表细胞死亡，因此这类方法只能判断出细胞抑制效果，而不能判断药物的杀菌效果。

由于环境中的菌会存在一种不生长但依然有代谢活性(NGMA)的状态，这种状态下的菌无法通过上述基于细胞生长的方法鉴别出来，但他们在后期疾病复发过程中起着关键性作用，是需要重点关注的对象。因此，仅依赖于生长的方法对于药物作用效果评价还有很大欠缺。

另一方面，不基于细胞生长的药物评价体系主要包括ATP生物荧光检测和碘化丙啶(PI)等荧光染料染色来判定细胞膜完整性等技术，由于其并不依靠细胞增殖故较前者省时，但是由于药物作用机制不同，导致其内部ATP的变化趋势或者对于细胞膜破坏性有显著不同，甚至出现相反的结论，因此该类方法判断有时会出现错误。且上述方法多基于群体水平的细胞研究，忽略了细胞间的异质性，无法对细胞耐药性等问题作全面评价。综上所述，开发新型抗菌剂包括新抗生素以及快速评价药物作用的手段和标准变得尤为重要。

单细胞拉曼技术以其简单、快速、无需标记、可提供丰富的细胞组分信息等特点日益成为测量细胞表型的重要手段。通过观测细胞内部大分子物质的变化，单细胞拉曼图谱(SCRS)可用于区分细胞种类及生长状态，以及鉴别产物积累等。最近，一种基于拉曼组学(Ramanome)的新方法被提出并应用于单细胞水平上判定外界刺激物包括药物对于细胞表型的影响(Teng,L.；Wang,X.；Wang,X.；Gou,H.；Ren,L.；Wang, T.；Wang,Y.；Ji,Y.；Huang,W.E.；Xu,J.,Label-free,rapid and quantitative phenotyping of stress responsein E.coli via ramanome. Sci Rep 2016,6,34359)。该方法基于细胞指纹区全谱的统计学分析，通过观测特殊拉曼峰位的变化判定细胞对于外界刺激物的响应，从而在一定程度上评价刺激物作用机制。但由于细胞内部组分变化微弱，加上拉曼图谱对于其它因素如细胞种类、细胞生长状态、以及测试环境等的敏感性，使得分析过程变得复杂且不适用于所有微生物，更不能应用于不可培养微生物。因此需要寻找一个更为清晰的具有普适性的标志用于评价药物作用，进而获得快速定量评价不同抗菌药物作用效果及筛选耐药菌的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速定量评价不同抗菌药物作用效果的方法。