[发明专利]一种接受外源基因定点整合的基因工程细胞系

说明书

本发明涉及外源基因定点整合的工程细胞系及其用途。该细胞系利用中国仓鼠卵巢细胞(CHO)作为宿主细胞通过插入识别标签在其Z4q3区而获得。本发明工程细胞系支持外源基因的定点整合，并长期维持外源蛋白的高效和稳定表达。

技术领域

本发明涉及细胞基因工程领域，具体涉及定点整合外源基因的CF细胞系及其在蛋白表达的用途。

背景技术

提高哺乳动物细胞外源基因表达水平和稳定性，一直是生物制药领域或基因工程领域不断发展的需求。尽管大多数商业化表达体系尤其表达载体都有针对性的优化设计，如选择强启动子，带有加压筛选系统等，但获得高表达外源蛋白的细胞仍然需要耗费巨大的精力和成本。通过常规技术引入外源基因的整合具有随机性，插入位置不支持强转录发生，并导致蛋白表达水平较低，即使短时的高水平表达，但也不能维持其稳定性，并随传代次数增加表达水平逐渐下降。因此，外源基因插入染色体的“位置效应”以及整合位点是否在高转录活跃区等被提出是影响蛋白表达水平及其稳定性的重要因素。只有对目的基因实施定向整合如整合至基因组的特定位置，才可能实现外源基因的稳定整合和蛋白高水平表达。

外源基因定向整合方法有多种，包括同源重组技术衍生的位点特异性重组技术，依靠针对特异识别位点的整合酶，在基因组和外源DNA间实现基因置换、基因敲出及敲入等基因工程操作。由于能够有效克服靶向性低、随机整合以及位置效应影响等缺点，定点整合技术在基因工程领域中的应用已为外源基因靶向定点整合奠定了良好基础。从20世纪80年代发展至今，位点特异性重组技术已有多种，其中最成熟的技术为FLP/FRT系统和Cre/loxP系统。FLP/FRT技术在哺乳动物表达系统中的应用开始于20世纪90年代初期。O’Gorman等应用FLP重组酶技术实现了将外源基因整合进入预先确定的哺乳动物细胞染色体位点(Science.1991Mar 15；251:1351-5.Recombinase-mediated gene activation and site-specific integration in mammalian cells)；Wiberg FC等应用FLP/FRT技术将编码抗体的基因整合进入CHO细胞基因组，首先在CHO细胞基因组特定位点插入1个FRT位点，建立含有单个FLP重组酶识别位点的宿主细胞系，然后将同样含有单个FRT位点的抗体表达载体以及FLP重组酶表达载体共转染宿主细胞，编码抗体的基因在FLP重组酶的作用下，定点整合在细胞基因组的相同位点，有效克服了位置效应对抗体表达水平的影响(BiotechnolBioeng.2006,94:396-405.Production of target-specific recombinant humanpolyclonal antibodies in mammalian cells.)。目前，通过FLP/FRT技术已推出系列商业化细胞系，包括Flp-In^TM-293、Flp-In^TM-CV-1、Flp-In^TM-CHO、Flp-In^TM-BHK和Flp-In^TM-3T3等，这些细胞系均可借助重组酶体系完成细胞基因组与外源DNA的位点特异性重组。然而，所述细胞系均为贴瓶生长，作为产业化用途尤其在表达治疗性蛋白或治疗性单克隆抗体方面的运用具有很大的局限性。中国专利(申请号：200310115022.4)公开了一种CHO/dhfr-细胞定点整合表达系统，该系统能够实现外源基因在CHO/dhfr-细胞基因组中定点整合和有效表达。PCT专利(2012)公开了一种染色体着陆垫(chromosomal landing pad)及其相关用途，尤其公开了强转录活性位点位于宿主细胞的Ank2、Cpsf4、C-Mos、Nephrocystin-1/Mal基因之内或附近的染色体着陆垫，这些染色体“着陆垫”均借助FLP/FRT技术实现，并成功用于外源基因的定点整合。中国专利(申请号：201510130235.7)公开了一种CHO细胞定点整合表达系统，该系统能够实现外源基因在细胞染色体基因组中1q12及1q13区实现定点整合和高效表达。