[发明专利]一种多肽衍生化方法及其在MALDI‑TOF‑MS检测药物代谢物中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及质谱检测领域，具体的为利用多肽衍生化代谢产物，结合MALDI-TOF-MS的方法及其在代谢组学领域的应用。

背景技术

代谢组学是继基因组学和蛋白组学之后，又一表征生命体系状况的研究领域，生物体内的代谢物的检测对研究基因表达、探索生命过程、诊断疾病和预防疾病等方面都具有深刻意义。因此，对代谢物分析是分析化学领域，乃至生命科学领域中的一个重要方向。

质谱作为小分子代谢物研究的重要手段，具有灵敏度高、专一性好、定性能力强等显著优点。目前对小分子代谢物最常见的质谱检测技术是液相色谱-质谱联用。虽然LC-ESI-MS的灵敏度高，但是LC-MS的检测时间长，不适用与快速高通量分析。

基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)由于检测快速、简便、高通量等特点，被广泛应用于DNA、蛋白质、多肽、多糖等大分子样品的检测。考虑到MALDI-TOF-MS检测的快速、简便、高灵敏度、高通量等优势，我们尝试将其拓展到对小分子代谢物的检测。MALDI-DOF-MS虽然在检测大分子物质上具有显著的优越性，但不适合检测代谢物这种小分子物质，主要是由于其通常所用的基质CHCA、DHB、3-HPA、2,4,6-THP等在小分子(<500Da)区段会对目标分析物有严重的基质干扰。为克服这一缺点，现有文献报道的方法主要分为两类：1)采用基质干扰小的基质，比如多孔硅、纳米微球、金属氧化物、碳材料等，但依然没有一种方便、广泛适用于基质被开发出来；2)设计大分子衍生化试剂衍生小分子待测物，现有文献报道的衍生化试剂的制备通常很繁琐和一定局限性。因此，在小分子化学物MALDI-TOF-MS分析中迫切需要发展一种简便的、高灵敏度、普适的衍生方法。

本发明针对上述问题，首次开发以多肽作为衍生化试剂来衍生小分子代谢物的新型MALDI-TOF-MS检测手段，从而克服MALDI-TOF-MA在小分子物质检测方面的优势，开拓MALDI-TOF-MS在代谢组学检测领域的应用。具有操作简便、快速、样品用量少等优点，特别适用于生物样品的分析。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种能应用于小分子代谢物检测领域中，结合化学衍生化策略的具有高灵敏度和普适性的MALDI-TOF-MS分析方法；

本发明提供的衍生化技术和分析方案包括如下步骤：

(1)通过PM3方法对多肽进行分子模拟和计算后，筛选到用于衍生化的多肽，该多肽含有在MALDI源中易电离的精氨酸、苯丙氨酸等基团；

(2)步骤(1)获得的多肽衍生待测小分子物质，使这些小分子带上易电离的氨基酸残基链。

本发明通过将含有氨基的化合物通过二醛衍生化，再通过分子模拟筛选出高灵敏度的多肽作为衍生化试剂，用N端修饰半胱氨酸和马来酰亚胺的多肽分别衍生醛类化合物类化合物，再用MALDI-TOF-MS检测这些经过多肽标记的小分子代谢物。

一种衍生化方法：采用序列为CFRGLRGF的多肽P2和序列为KFRGLRGF(Lys上修饰马来酰亚胺)的多肽P7分别作为醛类物质的衍生化试剂，水作为反应溶剂，磷酸缓冲溶液作为缓冲剂；

反应条件为：醛类化合物/多肽P2(20-100，c/c)加入到pH5-7的磷酸缓冲溶液中，4-37℃下衍生0.2-2h；

所述的衍生化反应是指含有Cys的多肽与醛类化合物发生的脱水缩合反应。

优选地，醛类化合物、多肽P2以摩尔比为50:1加入到pH为4的磷酸缓冲溶液中，25℃下，发生脱水缩合反应，5h。

由于所述的多肽衍生化试剂带有容易在MALDI-MS中结合质子发生电离的氨基酸残基，包括Arg(精氨酸)，Phe(苯丙氨酸)等，发现筛选出的多肽具有较高的质子亲和势，从而在质谱中容易结合质子，具有高灵敏度。

一种多肽化衍生结合MALDI-TOF-MS的定量分析方法：将小分子待测物衍生化后，与相应的稳定同位素内标1:1混匀，按照1μL待测液混合1μL基质(CHCA)点板；室温吹干后进入基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱分析，根据目标分析物谱峰强度与稳定同位素谱峰强度的比值对其进行定量分析。