[发明专利]一种利用茶树内生草螺菌促进茶叶富硒的应用技术

说明书

技术领域

本发明涉及的是利用茶树内生草螺菌促进茶叶中有机硒富集技术，特别是一种应用茶树内生草螺菌转化植物从土壤中吸收的有毒硒酸盐/亚硒酸盐并促进茶叶中有机硒富集的方法。

背景技术

硒是人和动物必需的微量元素之一，与机体的抗氧化能力、免疫功能、抗病毒、抗癌作用等有着十分密切的关系。土壤中的硒主要是以SeO₄^2-和SeO₃^2-的形式存在并溶于水，可通过根部吸收直接进入植物体内并转化为有机硒。有机硒才能被人体或动物有效利用。但是，高浓度的硒酸盐对动、植物有明显的毒性。鉴于硒具有高效抗氧化、抗癌、中和重金属毒性、高吸收利用率等独特的生物学效应，在家养动物生产、医药、保健品方面具有广泛的应用前景。在这种背景下，硒茶作为保健饮料越来越受到人们的青睐。可是，我国74%的地区缺硒或低硒，只有少数地区为富硒区，如湖北恩施、贵州开阳、陕西紫阳、湖南桃源和新田、广西永福、青海平安等。除了上述地区种植的茶叶可能含硒外，其它地区的茶叶中都不含硒。既使在富硒地区，周边含硒量低的区域种植的茶叶含硒量仍极低。为了提高茶叶中硒的含量，人们通常使用硒肥料或叶面喷洒亚硒酸钠。长期使用硒肥或叶面喷洒亚硒酸钠可能导致土壤、水体的硒污染。叶面喷洒亚硒酸钠还可能导致亚硒酸钠直接进入茶叶内，未还原的Se⁴⁺仍具有较强的生物毒性。为了减少环境污染、加快茶树对土壤或硒肥中硒酸盐的转化利用和促进茶叶中硒的富集，我们通过扦插苗繁殖，将茶树内生草螺菌引入茶树体内并与之共生以促进茶叶中有机硒富集，并建立了一种应用茶树内生草螺菌转化植物从土壤中吸收的硒酸盐以促进茶叶中有机硒富集的新技术。

茶树内生草螺菌是一种茶树共生专一性强的内生细菌，无致病性。文献“两株茶树内生草螺菌的微生物学特性”（王婷等，微生物学报2014第4期，2014.04.04，P424-432）详细叙述了茶树内生草螺菌的微生物学特性，但未涉及茶树内生草螺菌的应用。近期我们发现茶树内生草螺菌拥有完整的硒代谢途径，具有强的硒还原能力。在硒酸盐的刺激下，细菌能高效表达硒酶、硒醚水二潋酶、硫氧还原蛋白还原酶、谷胱甘肽S-转移酶、葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶。这些酶能有效地催化硒酸盐/亚硒酸盐的还原，产生的中间产物如硒化氢、硒磷酸、L-硒代半胱氨酸、R-S-谷光甘肽、乃至终产物硒蛋白可供茶树直接利用，促进茶叶中有机硒的富集。由于茶树内生草螺菌具有强的硒还原能力，定殖后的茶树内生草螺菌还能有效降低根部吸收的硒酸盐对茶树的生理毒害，有利于茶树体内硒的富集和向上转移。

发明内容

目前，生产中为了提高茶叶中硒的含量，通常使用硒肥料或叶面喷洒亚硒酸钠，长期使用硒肥或叶面喷洒亚硒酸钠可能导致土壤、水体的硒污染；叶面喷洒亚硒酸钠还可能导致亚硒酸钠直接进入茶叶内，未还原的Se⁴⁺仍具有较强的生物毒性。针对现有技术的不足，发明人提出一种利用茶树内生草螺菌与茶树共生促进茶叶中有机硒富集的方法，使用茶树内生草螺菌与茶树的扦插杆共培养，使草螺菌通过切口进入扦插杆内并定殖，茶树扦插苗成活后移栽在含硒土壤或施用硒肥的土壤里，定殖的茶树内生草螺菌有效地促进茶树对吸收进入体内的硒酸盐的转化利用，提高茶叶中有机硒的含量。

一种利用茶树内生草螺菌促进茶叶富硒的应用技术，其特征在于：通过茶树扦插条在草螺菌培养液中的浸泡，将草螺菌定殖于茶苗体内，使茶树从土壤中吸收的硒酸盐或亚硒酸盐转化成无毒的零价单质硒、有机硒或硒蛋白，实现茶叶中有机硒的富集；所述的该应用技术包括如下的步骤：

（1）茶树内生草螺菌的活化与培养

按文献“两株茶树内生草螺菌的微生物学特性”（王婷等，微生物学报2014第4期，2014.04.04，P424-432）的方法活化与培养细菌。取-80 °C保存的茶树内生草螺菌菌种，接种5mL营养肉汤培养基(10g胰蛋白胨，3g牛肉粉，5g NaCl，10μg/mL壮观霉素，5μg/mL氨苄青霉素，加水至1000 ml)，每分钟150转摇动，28 °C培养过夜。将活化后的菌液以1:100的体积比接入新鲜的LB液体培养基(10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g NaCl，10μg/mL壮观霉素，5μg/mL氨苄青霉素，加水至1000 ml， pH7.2-7.4)中， 摇床转速每分钟250转，温度为37 °C培养至OD₆₀₀=0.8-1.0，并加入1%甘油备用。

（2）茶树内生草螺菌处理与扦插苗繁殖