[发明专利]一种重组鸡干扰素λ（rChIFN‑λ）基因的克隆表达及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域中的干扰素领域，具体涉及一种重组鸡干扰素λ(rChIFN-λ)基因的克隆表达及其制备方法和应用。

背景技术

IFN-λ是近年来新发现的一类细胞因子，命名为Ⅲ型干扰素，其家族成员包括IFN-λ1、IFN-λ2、IFN-λ3与IFN-λ4，但鸡IFN-λ只有一种ChIFN-λ,DNA片段为561bp，蛋白大小约为22kDa。鸡IFN-λ具有一对特异的功能受体复合体(IFN-λR1/IL-10R2)，当鸡IFN-λ与受体复合体结合时，导致受体异二聚体化，可激活下游JAK-STAT信号转导，从而发挥广泛的生物学效应，包括抗病毒效应、免疫调节与抗肿瘤等等。已经有研究表明IFN-λ在一下病毒中发挥良好的抗病毒效应，比如，流感病毒、单纯疱疹病毒、肝炎病毒等。

新城疫是由禽副黏病毒科新城疫病毒(Newcastle Disease,ND)引起的一种禽类急性、高度接触性传染病，主要侵害鸡与火鸡。该病主要损害消化道、胃肠道与神经系统。新城疫不仅严重危害养禽业，同时也对世界经济业造成巨大损失，被世界动物卫生组织列为法定报告疾病，被中国列为一类动物疫病。

发明内容

本发明目的在于发明一种高效抗病毒活性重组鸡干扰素λ(rChIFN-λ)基因的克隆表达及其制备方法和应用。本发明所述的鸡干扰素λ生产简便，成本低，活性高，对新城疫和流感有良好的治疗效果。

本发明的第一目的是提供上述重组鸡干扰素λ(rChIFN-λ)蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明的另一目的是提供该蛋白的生产方法和原核表达质粒pET32a-rChIFNλ的制备方法。

本发明的再一目的是提供该蛋白在细胞上抑制病毒繁殖和在临床上治疗动物病毒性疫病的应用和效果。

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

步骤一：引物设计与合成。根据Genbank提供的鸡IFN-λ的基因序列(GenBank no.KF680102.1)，设计一对引物IFN-λ-F1,IFN-λ-R1，通过SignalP预测并除去信号肽，设计引物，分别在上下游插入EcoR1与Hind3两个酶切位点，为IFN-λ-F,IFN-λ-R。序列如下：

IFN-λ-F1：ATGGTATGCTACGGGGTCAC

IFN-λ-R1：CTAAGTGCAATCCTCGCGCTG

IFN-λ-F：CCGGAATTCCAGGTCACCCCGAAGAA

IFN-λ-R：CCCAAGCTTCTAAGTGCAATCCTCGCGCTGGGC

步骤二：基因克隆与鉴定。用SPF鸡胚自制鸡胚成纤维(CEF)细胞，使用POLY(I:C)刺激2h后，抽提RNA，经反转得到扩增鸡IFN-λ基因的模板cDNA，使用IFN-λ-F,IFN-λ-R引物扩增出鸡IFN-λ去信号肽的基因片段。

步骤三：将基因克隆至pMD-19T载体。将鸡IFN-λ基因连接至pMD-19T载体，16℃连接4h以上，转化至含氨苄琼脂平板，挑取单克隆菌放入LB培养基中摇菌，菌液PCR鉴定出阳性克隆，测序正确后扩大培养，提取质粒pMD-19T-rChIFN-λ。

步骤四：构建pET32a-rChIFN-λ重组质粒。分别将pMD-19T-rChIFN-λ与pET32a空载体用EcoR1与Hind3快切酶双酶切，胶回收后用T4连接酶，常温连接30min以上，转化至含氨苄琼脂平板，挑取单克隆菌放入LB培养基中摇菌，菌液PCR鉴定出阳性克隆，测序正确后扩大培养，提取重组质粒pET32a-rChIFN-λ。

本发明的有益效果如下：

本发明能提炼出较高浓度与活性的蛋白，为后续实验打下良好基础，且在细胞层面有良好抗病毒活性，针对鸡新城疫在动物体内有显著疗效。

附图说明

图1为PCR扩增的鸡IFN-λ基因琼脂糖核酸电泳图；其中，泳道M为DNA marker DL2000，泳道1为阴性对照，泳道2为chIFN-λ基因扩增结果。

图2为SDS-PAGE鉴定重组鸡干扰素λ(rChIFN-λ)蛋白表达结果图；其中，泳道M为低分子量蛋白Marker，泳道1为pET-32a空载体包涵体变性前，泳道2为pET-32a空载体包涵体复性后，泳道3为重组鸡干扰素λ(rChIFN-λ)包涵体变性前，泳道4为重组鸡干扰素λ(rChIFN-λ)包涵体复性后。